欧美杨111号组织培养再生体系的建立

矫丽曼

（辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115200）

欧美杨111号组织培养再生体系的建立

矫丽曼

（辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115200）

以欧美杨111号叶片为外植体，以MS和1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA、6-BA和IBA，观察不定芽诱导和生根情况，确定欧美杨111号植株再生体系。结果显示：欧美杨111号叶片最佳分化培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+琼脂6 g·L-1，pH值6.5，不定芽分化率为96.67%；最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6 g·L-1，pH值6.0，全部生根，平均根数13.2条。

欧美杨111号；组织培养；再生体系；外植体

欧美杨111号Populus euramericana‘Bellotto’植物新品种保护登记名称为“贝洛托111”，是意大利杨树研究所利用人工控制授粉，通过有性杂交试验所获得的杂交无性系，雌性植株。母本为美洲黑杨P.deltoides‘217/958’，父本是自由授粉的欧美杨无性系。1984年中国林业科学研究院张绮纹从意大利引入［1］。2002年通过国家林业局植物新品种保护审定，编号：20020005。欧美杨111号树干通直、树冠窄小、侧枝细、树形美观，生长速度快，是有很强的耐旱、耐低温、抗害虫、抗溃疡病的优良品种，无性繁殖容易，抗风能力强，落叶期晚，轮伐期短，材质好，是纸浆材和板材的优良原材料，适合在我国东北的南部、华北、华东、内蒙、华南及西南等广大地区种植［2-4］。

为提高欧美杨111号的抗逆性，通过转基因的手段将带有特异功能的外源基因导入体内，在受体上表达，而组织培养再生体系的建立为转基因的成功提供了基础与前提。本文建立了欧美杨111号组织培养再生体系，为该杨树品种的广泛推广、抗性及分子水平的研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2016年3月末从辽宁省杨树研究所锦州市金城苗圃采集欧美杨111号1年生枝条，置于室内水培萌发，幼叶伸展后，以萌发的幼叶作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 欧美杨111号外植体的选择及预处理［5-7］

选取萌发伸展长度在1 cm以上的幼叶，用剪刀将叶片剪下，用自来水冲洗干净，放入无菌平皿中。在无菌条件下，用75%的乙醇溶液冲洗3次，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡5 min，取出后用无菌水冲洗数次，用无菌剪刀将叶片的两端剪掉，并在叶片中间与叶脉平行处剪开几个裂口，即获得无菌外植体叶片。

1.2.2 不定芽分化培养基的优化［8-10］

不定芽分化培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA和6-BA（表1），将处理好的无菌外植体分别接种于不同培养基中诱导，同时培养基中添加蔗糖25 g·L-1、琼脂6 g·L-1，pH值6.5，每个处理重复3次，共接30个叶片。

1.2.3 生根培养基的优化［11-12］

生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的IBA（表2），同时添加蔗糖20 g·L-1，琼脂6 g·L-1，pH值6.0。剪下生长长度超过2 cm的不定芽，每瓶接2个不定芽，4瓶为1个处理，重复3次，共接24个不定芽。

1.2.4 培养条件及计算方法［13-14］

接种后的各处理放在组织培养室内，培养温度25℃，光照强度2 000～2 500 lx，每天照明14 h，接种的分化苗每3周转接1次，20 d后观察叶片的分化情况、分化时间及分化数量。培养40 d后统计分化的叶片数和分化的不定芽数，计算平均分化芽和不定芽分化率。

2 结果与分析

2.1 不定芽分化培养基的确定

随着叶片培养时间的增加，先在叶片的剪切口处开始膨大，形成嫩绿色的瘤状愈伤组织，之后变成暗红色，约27 d后在愈伤组织处分化出不定芽。从表1可以看出，欧美杨111号叶片平均分化芽2.6～22.8个，不定芽分化率20.00%～96.67%，其中7、10、11、12、13号的不定芽分化率高于其他，10号最高为96.67%。芽长势见图1。

表1 欧美杨111号叶片在不同培养基上的分化情况

同时采用相同的方法对叶柄分化培养基进行了筛选，结果与叶片相同，只是叶柄开始分化时间早于叶片5 d左右。

因此确定欧美杨111号叶片不定芽最佳分化培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+琼脂6 g·L-1，pH值6.5。

2.2 不定芽生根培养基的确定

10 d左右在茎的基部开始膨大，之后长出小根，初为红色，随着根的伸长变成浅红、乳白色，培养到20 d左右计算生根率。由表2可知，不定芽培养15 d左右开始生根，生根的不定芽数18～24个，生根率75%～100%。其中3号的生根率最高为100%，平均生根数为13.2条。因此确定欧美杨111号不定芽最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，pH值6.0。

图1 欧美杨111号叶片在分化培养基上分化及不定芽的生长状况

表2 欧美杨111号不定芽在不同培养基上的生根情况

3 结论与讨论

3.1 外植体的选择

同一植株上不同器官的再生能力有所不同，即使同一器官的不同部位，再生能力也有差异［15］。本试验采用叶片为外植体进行组织培养再生体系的建立，同时也剪取了叶柄和叶芽为外植体，叶柄的分化要早于叶片，但在分化后期基本相同。叶芽为外植体几乎未分化。

3.2 外植体的预处理

对大多数植物来说，挑选新生的幼叶、叶柄或茎尖做为外植体，必须根据剪材时间、材料的幼嫩程度等选择消毒剂。本文采用75%的乙醇溶液和0.1%的氯化汞作为消毒剂，并在无菌的条件下进行清洗和消毒，降低了外植体在接种培养过程中的感染率。

3.3 不同激素对杨树不定芽分化及生根的影响

植物愈伤组织不定芽的分化直接取决于培养基的种类、添加激素的种类与浓度。常用的林木组织培养培养基有MS、WPM和GMS，用的最多的是MS培养基。杨树组织培养中常用的有生长素（IAA、NAA、IBA和2，4-D）和细胞分裂素（KT、6-BA、ZT、2ip、BAP）。本试验用6-BA、NAA来诱导欧美杨111不定芽的分化，其最适分化培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+琼脂6 g·L-1，pH值6.5。用IBA诱导生根，其最适生根培养基为1/2MS+IBA 0.3m g·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6 g·L-1，pH值6.0。不定芽分化率96.67%，平均分化芽22.8个，全部生根，平均根数13.2条。

本研究以欧美杨111号为试验材料，通过对植物生长调节剂的种类、浓度等的研究，建立起组织培养再生体系，为该杨树在全国范围内推广提供了前提基础，也为基因工程育种的研究提供了基本条件和保障。

［1］李文荣，任建中，段自安，等.杨树与柳树新品种及其栽培［M］.北京：中国林业出版社，2008.

［2］张绮纹，李金花.杨树工业用材林新品种［M］.北京：中国林业出版社，2003.

［3］尹伟伦.中国杨树栽培及利用研究［R］.北京：中国林业出版社，2005.

［4］陈章水.杨树栽培实用技术［M］.北京：中国林业出版社，2005.

［5］陶延珍，李枫，李毅.箭杆杨组织培养再生体系的建立［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（3）：203-207.

［6］赵鑫闻.甜杨叶片高频植株再生体系的建立［J］.中国农学通报，2015，31（34）：6-9.

［7］杨传平，郑琼，马旭俊，等.欧美杨“山地1号”组织培养再生系统的建立［J］.分子植物育种，2006，4（4）：579-582.

［8］张蕾，苏晓华，张冰玉，等.京2杨组培条件的优化与再生体系建立［J］.林业科学研究，2007，20（6）：787-793.

［9］康冰，王关平，张小红，等.欧美黑杨离体再生途径及影响因子的研究［J］.西北植物学报，2004，24（12）：2355-2358.

［10］李开隆，靳春莲，李明德.香杨的组织培养和植株再生［J］.植物生理学通讯，2009，45（3）：281.

［11］樊军锋，李玲，韩一凡，等.84K杨叶片外植体再生系统的建立［J］.西北林学院学报，2002，17（2）：33-36.

［12］张冰玉，苏晓华，郑书星.山新杨叶片高频植株再生体系建立及其遗传稳定性［J］.北京林业大学学报，2008，30（3）：68-73.

［13］冯连荣.盖杨叶片高频植株再生体系的建立［J］.安徽农业科学，2016，44（1）：209-211.

［14］赵鑫闻，彭儒胜，赵继梅.辽宁杨叶片高频植株再生体系的建立［J］.中国农学通报，2015，31（10）：13-16.

［15］孙宇飞，高秀华，赵彦修，等.欧美107杨组织培养再生系统的建立［J］.山东师范大学学报（自然科学版），2004，19（2）：85-87.

（责任编辑：张素清）

Establishment of tissue culture regeneration system of Populus euramericana‘Bellotto’

JIAO Liman
（LiaoningProvincialInstituteofPopulus，Gaizhou115200，China）

In order to establish plant regeneration system of Populus euramericana‘Bellotto’by tissue culture，leaves of P.euramericana‘Bellotto’were used as explants，MS and 1/2MS were used as basic culture medium，which added with different concentrations of NAA，6-BAand IBA，and the adventitious bud induction and rooting situations were observed.Results showed that:the optimum medium for adventitious bud differentiation was MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+sucrose 25.0 mg·L-1+agar 6.0 mg·L-1，pH 6.5；the optimum medium for rooting was1/2MS+IBA0.3 mg·L-1+sucrose 20.0 mg·L-1+agar 6.0 mg·L-1，pH 6.0.

Populus euramericana‘Bellotto’；tissue culture；regeneration system；explant

S722.37

A

1001-1714（2017）01-0015-04

2016-11-06

矫丽曼（1981-），女，工程师，主要从事杨树转基因育种和森林保护等方面研究。E-mail：jiaoliman1025@163.com。