乳酸菌氧化锆珠破壁方法的优化及适用性研究

潘荣荣,王茂鹏,李 昌,邸 洋,荣凤君,杜寿文,朱羿龙,刘立明,朱国强,金宁一，*

(1.扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009;2.军事医学科学院军事兽医研究所,省部共建吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;3.温州大学病毒病研究所,浙江温州 325035)



乳酸菌氧化锆珠破壁方法的优化及适用性研究

潘荣荣1,2,王茂鹏2+,李 昌2,3,邸 洋2,荣凤君2,杜寿文2,朱羿龙2,刘立明3,朱国强1，*,金宁一2,3，*

(1.扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009;2.军事医学科学院军事兽医研究所,省部共建吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;3.温州大学病毒病研究所,浙江温州 325035)

本实验旨在优化氧化锆珠破壁方法,以期筛选出较佳的破壁条件,提高蛋白得率。实验在菌体重量、研磨buffer和研磨时间这3方面对该破壁方法进行了优化,并通过SDS-PAGE来分析其破壁效果。在优化后的条件下,同时对6株乳酸菌进行破壁处理并通过SDS-PAGE来分析其破壁效果。结果表明:在菌体重量、研磨buffer、锆珠三者的加入比例(W/V/W)为0.013 g∶300 μL∶1 g的条件下,研磨15 min,提取的蛋白图谱条带清晰,丰度高;RIPA、PBS、PENP、GUS作为研磨buffer时,提取的蛋白图谱条带清晰且丰度高,而8 mol/L尿素作为研磨buffer时,图谱条带模糊且丰度低;6株乳酸菌经该方法破壁处理后,蛋白图谱条带均具有较高的丰度和清晰度。因此,对于乳酸菌的破壁,氧化锆珠破壁法具有快速、高效的优点。

乳酸菌,氧化锆珠,优化,适用性

细胞破壁方法很多:生物法,如酶溶法;化学法,如酸热法;物理法,如反复冻融法、超声破壁法、机械法和微波法等,各有优缺点[1-3]。我们需要根据细胞的结构和化学组成选择合适的破壁方法[4]。革兰氏阳性菌,具有厚而致密的刚性细胞壁,破壁较困难,目前对于革兰氏阳性菌的破壁,已有较多文献报道,如:胡桂萍等[5]利用玻璃珠破碎芽胞杆菌细胞壁提取蛋白;赵春燕等[6]利用溶菌酶破碎乳酸菌细胞壁提取菌体蛋白;孙慧慧等[7]通过改良的 CTAB法破碎节杆菌细胞壁提取基因组DNA;邹晓蕾等[8]采用Triton X-100法提取嗜盐四联球菌总RNA。近年来,氧化锆珠破壁法以其快速、高效、经济的特点而被广泛应用[9]。该方法可以在短时间内破碎裂解样品且研磨过程中产生的热量少,可以最大限度的避免核酸的降解和蛋白的变性。此外,氧化锆珠具有以下特点:极低的(ppm级)磨耗(耐磨性是玻璃珠的30～50倍);极高的硬度;极高的密度(能有效提高研磨效率);耐高温耐腐蚀;可以多次重复使用,使用成本低[9-11];氧化锆珠破壁法是一种快速、高效、经济、高通量的破壁方法。

目前,关于利用氧化锆珠破碎乳酸菌细胞壁的报道主要集中在国外[12-14],但在国内外尚未发现在菌体重量、研磨buffer、研磨时间这3方面对氧化锆珠破壁方法进行优化的研究。

乳酸菌是指一类可发酵碳水化合物并产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称,它们的形态、代谢性能和生理学特征不完全相同[15],每一种菌体由于其各自特点不同,经同一种破壁方法处理后,可能产生的破壁效果就具有较大差异[16]。因此,本文还探究了氧化锆珠破壁方法对6株乳酸菌破壁的适用性,以期探索出一种更快速、更高效、更经济、通用的乳酸菌破壁方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

副干酪乳杆菌(L.caseisubsp.casei20296)、唾液乳杆菌(L.salivariussubsp.salicinius23174) CICC;德氏乳杆菌(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus1.2161)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus1.1878)、植物乳杆菌(L.plantarum1.557)、乳酸乳球菌(NZ3900) CGMCC;MRS培养基、M17培养基 青岛高科园海博生物方法有限公司。

MCO-18M型CO2恒温培养箱 日本SANYO公司;BSIII型电子天平 北京赛多利斯天平有限公司;5417R小型台式高速离心机 德国eppendorf公司;Tissue Lyser II 组织研磨仪 德国QIAGEN公司;0.1μm氧化锆 珠河源帝诺新材料有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳杆菌的培养与收集 无菌条件下接一环保藏菌种在MRS固体培养基上划线培养,37 ℃培养 24 h,长出单克隆后,挑取单个菌落在MRS固体培养基上继续划线培养,如此连续传两代[17]。将MRS平板培养基上新鲜活化的单菌落挑至5 mL MRS液体培养基,37 ℃厌氧条件下静置培养12 h[18-19]。12000 r/min,离心1 min,收集菌体。用1 mL预冷的洗涤液(100 mmol/L磷酸缓冲液,10 mmol/L EDTA)洗涤菌体,洗涤3次,再用PBS洗涤3次,12000 r/min离心1 min,收集菌体。

1.2.2 乳酸乳球菌的培养与收集 无菌条件下接一环保藏菌种在M17固体培养基上划线培养,30 ℃培养 24 h,长出单克隆后,挑取单个菌落在M17固体培养基上继续划线培养,如此连续传两代。将乳酸乳球菌的M17平板培养基上新鲜活化的单菌落挑至5 mL GM17液体培养基,30 ℃厌氧条件下静置培养12 h[20-21]。12000 r/min,离心1 min,收集菌体。用1 mL预冷的洗涤液(100 mmol/L磷酸缓冲液,10 mmol/L EDTA)洗涤菌体,洗涤3次,再用PBS洗涤3次,12000 r/min离心1 min,收集菌体。

1.2.3 氧化锆珠的前处理 用5.8 mol/L HCl覆盖氧化锆磨介,室温振荡处理过夜。弃上清,加入灭菌水清洗(每次清洗都要反复振荡),共洗10次。最后,放入平皿中铺散开,75 ℃烘干备用[14]。

1.2.4 氧化锆珠法破壁 按照方法1.2.1培养与收集1 mL菌液,加入300 μL预冷的研磨buffer并重悬菌体,再加入1 g预冷的氧化锆珠,然后,放入组织研磨仪中振荡研磨(振荡频率为30次),研磨20 min。研磨结束后,用1 mL注射器在研磨后的离心管底部扎一个小孔,并将扎孔的离心管立即放入另一新的预冷的1.5 mL离心管,4 ℃,5000 r/min,离心5 min,收集研磨后蛋白上清[14]。

1.2.5 氧化锆珠破壁条件的参数选择及实验设计 选择氧化锆珠破壁的3个主要条件:菌体重量、研磨buffer、氧化锆珠三者的加入比例(W/V/W)、研磨buffer和研磨时间,并确定各条件的水平范围[6,22]。

1.2.5.1 优化菌体重量的实验设计 在固定研磨buffer为RIPA裂解液,加入体积为300 μL,氧化锆珠加入量为1 g,研磨时间为20 min的条件下,菌体重量选取0.0173,0.0132,0.0084,0.0043 g,考察菌体重量对乳酸菌破壁效果的影响。

1.2.5.2 优化研磨时间的实验设计 在固定研磨buffer为RIPA裂解液,加入体积为300 μL,氧化锆珠加入量为1 g,菌体重量为0.013 g的条件下,研磨时间选取5,10,15,20,25 min,考察研磨时间对乳酸菌破壁效果的影响。

1.2.5.3 优化研磨buffer的实验设计 在固定研磨buffer加入体积为300 μL,氧化锆珠加入量为1 g,菌体重量为0.013 g,研磨时间为20 min的条件下,研磨buffer选取:RIPA裂解液(强)(pH7.4);PBS(pH7.4);PENP(pH=7,10 mmol/L磷酸三钾、10 mmol/L EDTA、50 mmol/L、NaCl 1 mmol/L PMSF);GUS(pH=7，50 mmol/L磷酸缓冲液、10 mmol/Lβ-巯基乙醇、1 mmol/L EDTA、0.1% TritonX-100);8 mol/L尿素(pH=7.4);考察研磨buffer对乳酸菌破壁效果的影响。

1.2.5.4 SDS-PAGE检测乳酸菌破壁效果 从收集的蛋白上清中各取50 μL,直接加入12.5μL 5×SDS 样品缓冲液,充分混匀,煮沸5 min,各取15 μL煮沸后样品进行12% SDS-PAGE分析。

1.2.6 氧化锆珠破壁法对于乳酸菌破壁的适用性研究

1.2.6.1 6株乳酸菌菌壁的破碎 分别称取6管重量相同的不同菌体(副干酪乳杆菌,德氏乳杆菌,嗜酸乳杆菌,唾液乳杆菌,植物乳杆菌,乳酸乳球菌)。接下来按照方法1.2.4进行氧化锆珠研磨,收集上清。

1.2.6.2 SDS-PAGE检测6株乳酸菌破壁效果 从收集的蛋白上清中各取50 μL,离心后取上清,直接加入12.5 μL 5×SDS 样品缓冲液,充分混匀,煮沸5 min,各取15 μL煮沸后样品进行12% SDS-PAGE分析。

2 结果与分析

2.1 氧化锆珠破壁条件的优化

由图1可知,在研磨buffer、锆珠的加入量分别为300 μL、1 g,研磨buffer为RIPA的条件下时,随着菌体重量的增加,SDS-PAGE蛋白图谱条带数目越来越多且清晰度越来越高,但当菌体重量达到0.0132 g时,即使再增加菌体重量,蛋白图谱条带的丰度以及清晰度也基本上不再变化。说明0.0132 g菌体已达到该研磨体系的最大值,若要增加研磨菌量,则必须相应增加研磨buffer、锆珠的加入量,此外,从蛋白图谱条带的丰度来看,菌体蛋白释放较完全。所以菌体重量、研磨buffer以及氧化锆珠三者的加入比例(W/V/W)为0.013 g∶300 μL∶1 g较佳。

图1 菌体重量的优化Fig.1 Optimization of cell weight注：1～4:0.0173、0.0132、0.0084、0.0043 g菌体加入量，M：(14～100 kDa)Protein Marker。

由图2可知,在菌体重量、研磨buffer以及氧化锆珠三者的加入比例(w/v/w)一定,研磨buffer为RIPA的条件下,随着研磨时间的延长,SDS-PAGE蛋白图谱条带数目越来越多且清晰度越来越高,但当研磨时间达到15 min时,即使再增加研磨时间,蛋白图谱条带的丰度以及清晰度也基本上不再变化。说明在该研磨体系,研磨15 min,已可以较完全破碎菌体。所以在菌体重量、研磨buffer(RIPA)以及氧化锆珠三者的加入比例(w/v/w)为0.013 g∶300 μL∶1 g时,研磨15 min较佳。

图2 研磨时间的优化Fig.2 Optimization of grinding time注：1～6：0、5、10、15、20、25 min；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

由图3可知,在菌体重量、研磨buffer以及氧化锆珠三者的加入比例(w/v/w)为0.013 g∶300 μL∶1 g,研磨时间为15 min的条件下,8 mol/L尿素作为研磨buffer时,蛋白图谱条带模糊且丰度低,菌体蛋白释放不完全。而其余四种(RIPA,PBS,PENP,GUS)作为研磨buffer时,蛋白图谱条带清晰且丰度高,菌体蛋白释放较完全。图中也可看出这四种buffer的研磨效果相差不大。所以除8 mol/L尿素外，其余四种(RIPA,PBS,PENP,GUS)作为研磨buffer都较适宜。

图3 研磨buffer的优化Fig.3 Optimization of grinding buffer注：1～5:RIPA、PBS、PENP、GUS、Urea；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

综上研究结果,在菌体重量、研磨buffer以及氧化锆珠三者的加入比例(w/v/w)为0.013 g∶300 μL∶1 g,研磨buffer为RIPA、PBS、PENP、GUS中的任意一种的条件下,研磨时间为15 min,破壁效果较佳。

2.2 氧化锆珠破壁法对于乳酸菌破壁的适用性研究

由图4,图5可知,6株乳酸菌经氧化锆珠破壁后,SDS-PAGE蛋白图谱条带均具有较高的丰度和清晰度,在14～100 kDa都有比较清晰的条带,说明菌体蛋白均收获较完全。因此,对于乳酸菌的破壁,氧化锆珠破壁法具有较好的适用性。

图4 5株乳杆菌破壁的SDS-PAGE效果图Fig.4 SDS-PAGE rendering of five strains of lactobacillus wall-breaking注：1：副干酪乳杆菌，2：德氏乳杆菌，3：嗜酸乳杆菌，4：唾液乳杆菌，5：植物乳杆菌(Lp WCFS1)；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

图5 乳球菌破壁的SDS-PAGE效果图Fig.5 SDS-PAGE rendering of lactococcus wall-breaking注：1,2-乳酸乳球菌；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

3 讨论

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是能发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌的通称,主要包括肠球菌、乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、链球菌及双歧杆菌等。大多数乳球菌和乳杆菌是公认的食品级的微生物[23]。其内源蛋白以及其他非分泌性代谢产物广泛应用于食品工业、农业生产等领域[24-25]。但由于破壁困难,限制了部分应用。因此,寻找一种有效的破除乳酸菌细胞壁的方法,能扩展乳酸菌等食品微生物在食品工业中的应用。氧化锆铢破壁提供了一种有效的手段,但是影响破壁效果的因素较多,需要进行优化。

本实验在菌体重量、研磨buffer、氧化锆珠三者的加入比例(w/v/w)、研磨buffer的选择、研磨时间这3方面对氧化锆珠破壁条件进行了优化。从研磨buffer的优化结果来看,RIPA、PBS、PENP、GUS这四种buffer都较适宜作为研磨buffer,选择PENP作为研磨buffer,所提取的蛋白可以用于DNA体外修饰[12],选择GUS作为研磨buffer,所提取的蛋白可以用于GUS酶活力的测定[13],若所提取的蛋白用于SDS-PAGE分析,Western-blot分析,可以选择成本较低,配制方便的PBS作为研磨buffer,也可选择购买商品化的RIPA裂解液。从研磨时间的优化结果来看,氧化锆珠破壁法可以在短时间内(10～15 min)破碎裂解样品,说明氧化锆珠破壁法是一种非常快速、高效的破壁方法。

此外,本实验也验证了氧化锆珠破壁法对于乳酸菌的破壁具有良好的适用性,此方法也许能成为一种通用有效的破壁手段。本文通过对氧化锆珠破壁条件的优化,指明了该方法潜在的影响因素,有利于进一步的优化研究,使其在食品工业领域具有工艺放大的可行性,同时也为进一步探索经济、高效的乳酸菌破壁方法提供技术参考。

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Optimization of zirconia beads wall-breaking method for lactic acid bacteria and study on its effect of the applicability

PAN Rong-rong1,2,WANG Mao-peng2+,LI Chang2,3,DI Yang2,RONG Feng-jun2,DU Shou-wen2, ZHU Yi-long2,LIU Li-ming3,ZHU Guo-qiang1，*,JIN Ning-yi2,3，*

(1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Jilin Province,Institute of Military Veterinary,Academy of Military Medical Sciences,Changchun 130122,China; 3.Institute of Viral Diseases,Wenzhou University,Wenzhou 325035,China)

This study aims to optimize the zirconia beads wall-breaking method,screen out the better broken conditions for breaking lactic acid bacteria cell wall and improve the protein yield.The weight of bacteria,the grinding buffer and time were tested and selected as important aspects to optimize the wall-breaking method,and then,the breaking effect was analyzed and evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE).Under optimized conditions,six different species of strains from lactic acid bacteria were tested for cell wall-breaking treatments with the zirconia beads method,after that,the breaking effects were analyzed and evaluated by SDS-PAGE.Results showed that,on condition that the ratio of bacteria,grinding buffer and zirconia beads(W/V/W)is 0.013 g:300 μL:1 g,grinding time of 15 min,the protein pattern with clear banding,high abundance;RIPA,PBS,PENP,GUS as the grinding buffer,the protein pattern with clear banding,high abundance,while 8 mol/L urea as the grinding buffer,the protein pattern with obscure banding,low abundance. After Six strains of lactic acid bacteria were broken through this method,the protein pattern with clear banding,high abundance.Therefore,zirconia beads method is a combined rapid and efficient method for breaking lactic acid bacteria cell wall.

lactic acid bacteria;zirconia beads;optimization;applicability

2016-11-11 +为并列第一作者

潘荣荣(1989-),女,硕士,研究方向:兽医免疫学,E-mail:2281078335@qq.com。 王茂鹏(1987-),男,博士,研究方向:分子免疫学,E-mail:wangmaopeng@126.com。

*通讯作者:朱国强(1964-),男,博士,教授,研究方向:(病原)微生物和(动物)机体的相互作用的分子机理,E-mail:yzgqzhu@yzu.edu.cn。 金宁一(1956-),男,博士,研究方向:分子病毒学与免疫学,E-mail:ningyik@126.com。

国家自然科学基金(31472197);病原微生物生物安全国家重点实验室开放课题(SKLPBS1435)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0140-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.018