miRNA-126在支气管哮喘中的表达及临床意义

穆清爽 张 慧 汪文娟 薄聪聪 黎 静

(新疆医科大学第二附属医院，新疆 乌鲁木齐 830063)

miRNA-126在支气管哮喘中的表达及临床意义

穆清爽 张 慧 汪文娟 薄聪聪 黎 静

(新疆医科大学第二附属医院，新疆 乌鲁木齐 830063)

目的 探讨检测miRNA-126基因在支气管哮喘患者及健康者外周血中的表达及在哮喘急性加重期的临床意义。方法 哮喘急性加重期患者24例为哮喘组，健康志愿者24例为对照组。留取外周血标本，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测miRNA-126基因的表达，分析其表达差异情况以及与白细胞介素(IL)-6细胞炎症因子、嗜酸性细胞、IgE的关系，受试者工作特征曲线(ROC)特征评价miRNA-126基因对支气管哮喘诊断的预测价值。结果 两组miRNA-126相对含量差异有统计学意义(Z=-2.444，P=0.015)。哮喘组IL-6、嗜酸性细胞、IgE比率显著高于对照组(P<0.01)。miR-126在支气管哮喘患者血浆中ROC曲线下面积(AUC)为0.294，诊断价值较低。结论 miRNA-126在哮喘急性加重期患者外周血中表达，呈下调状态，可能通过辅助T细胞(Th)2优势应答，使炎性细胞因子升高，有可能成为治疗哮喘的新靶点。

miRNA-126；哮喘

目前研究发现miRNAs在哮喘中具有重要作用，也能用于哮喘基因个体易患性判断〔1〕。其中miRNA-126能抑制哮喘的表型，并能减少辅助T细胞(Th)2反应、气道高反应性、嗜酸性细胞聚集，弱化气道黏液分泌，从而抑制哮喘炎症产生〔2〕。本研究旨在探讨mRNA-126在支气管哮喘患者急性发作期血浆中的表达水平及其意义。

1 资料与方法

1.1 对象 哮喘组为2015年3～9月新疆医科大学第二附属医院住院部就诊的哮喘急性加重期患者血标本24例，其中男10例，女14例，年龄21～52岁，中位年龄38岁。诊断和病情分级符合2014年中华医学会呼吸分会哮喘组制定的专家共识诊疗规范。对照组为新疆医科大学在校学生，其中男12例，女12例，年龄21～23岁，对照组无过敏性鼻炎及呼吸道感染史。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 采集研究对象的空腹静脉血5 ml，30 min内3 000 r/min离心5 min分离血清，置于5 ml离心管中，于4℃条件下16 000 r/min离心10 min，吸出上清液置新的离心管中，置-80℃冰箱低温保存。

1.2.2 主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒(miRNeasy Mini kit，QIAGEN公司)，逆转录试剂盒 (miScript II RT Kit，QIAGEN公司)，RT-PCR试剂盒(miScript SYBR®Green PCR kit，QIAGEN 公司)。主要仪器:美国ABI 7300Real Time PCR System扩增仪。

1.2.3 血浆总RNA的提取和RT-PCR (1)提取总RNA：用超微量核酸蛋白测定仪测定其浓度及纯度，RNA浓度和纯度在260/280 nm 下检测，在1.9～2.20 之间。(2)逆转录合成cDNA：反应体系20 μl：HIFlex Buffer 4 μl，Nucleics Mix 2 μl，RT Enzyme Mix 2 μl，Total RNA(浓度约20 ng/μl)+ RNase-Free 水共12 μl。(3)实时荧光定量PCR反应(RT-PCR)：引入MiR-126特异性引物(货号：ms00003430)反应体系25 μl：Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，miScript Primer Assay 2 μl，miScript Universal Primer 2 μl，RNase-Free 水10 μl，模板cDNA 1 μl。反应条件：95℃ 15 min，1个循环；94℃ 15 s，55℃ 45 s，70℃ 30 s，35个循环。每个样本做3个复孔，在相同反应条件下同时检测MiR-126的扩增情况，程序运行后数据分析用Rotor-Gene Q Series Software软件，最后得出各样本的熔解曲线、扩增曲线及Ct值。(4)结果检测与分析：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，miRNA-126的相对含量为2-ΔΔCt。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行秩和检验、p检验。

2 结 果

2.1 两组血浆miRNA-126的表达水平 miRNA-126在哮喘组和对照组的相对含量分别为(351 540.000±464 095.000)和(568 670.000±459 555.400)，两组比较差异有统计学意义(Z=-2.444，P=0.015)。

2.2 两组外周血炎性因子比较 与对照组比较，哮喘组中IL-6细胞炎症因子、嗜酸性细胞、IgE水平显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 两组外周血炎性因子比较

2.3 miRNA-126水平在哮喘诊断中的灵敏度、特异度 受试者工作特征(ROC)曲线分析，miR-126在支气管哮喘患者血浆中ROC曲线下面积(AUC)为0.294 (95%CI0.130～0.459)，诊断价值较低。见图1。

图1 血浆miRNA-126浓度的ROC曲线分析

3 讨 论

哮喘是以持续气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的慢性呼吸道疾病，是呼吸科最常见的慢性呼吸道疾病之一。因为其发病机制迄今尚未完全阐明，所以，目前治疗手段尚不能完全阻止气道重塑和急性发作。研究认为炎性细胞因子网络失衡在支气管哮喘的发病机制中起着重要作用，Th1/Th2细胞因子平衡学说是最早被提出的与免疫相关的支气管哮喘炎症发病机制学说〔3〕。Th2优势分化免疫应答释放Th2型细胞因子增多，加重嗜酸性粒细胞气道炎症，导致哮喘急性发作〔4〕，miRNA-126能抑制哮喘的表型，并能减少Th2反应、气道高反应性、嗜酸性细胞聚集和黏液过度分泌，针对哮喘气道高反应的miRNA治疗可达到抗炎症的目的〔5〕。在慢性迁延性哮喘小鼠模型中，气道内miRNA-126表达显著升高，在慢性激发期下调miRNA-126，能减轻气道内嗜酸性粒细胞浸润，改善哮喘的症状〔6〕。

单个microRNA能和数百种靶向基因结合，通过对靶基因转录后的调控机制，参与炎性疾病及免疫异常相关疾病的调节，是负反馈调节的重要调控因子。miRNA-126通过多种途径调节免疫系统参与哮喘的炎症反应过程。miRNA-126 在气道管壁细胞中依赖髓样分化因子(MyD)88和Toll样受体(TLR)4 表现出上调趋势，通过 miRNA拮抗剂抑制miRNA-126高表达后，抑制Th2 细胞释放IL-5 和IL-13炎性细胞因子，气道黏液分泌量呈减弱趋势，从而减轻哮喘急性发作症状〔7，8〕。

在哮喘气道炎症的产生过程中，IgE是介导Ⅰ型超敏反应的重要物质，IgE 通过与其受体结合发挥作用，当抗原在与机体再次接触后，激活IgE复合物受体，借助肥大细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞的表面Fc受体〔9〕，并被T细胞受体识别，从而激活Th亚群，释放IL-2、IL-4、IL-6、IL-13等炎性因子。本研究推测miRNA-126下调可能通过调节Th平衡，造成Th2优势应答，使B淋巴细胞增殖分泌IgE，导致嗜酸性粒细胞及炎性介质IL-6增高。而卢兰等〔10〕研究表明miRNA-126在哮喘患者中高表达，并可能通过调节TSLP 调控Th2 细胞的优势分化、Th2 型细胞因子水平参与哮喘的调控机制。

本研究采用RT-PCR法检测，在空间表达分辨率、准确性、灵敏度、特异度方面较之基因芯片技术和Northern 杂交技术有无法比拟的优势〔11〕，实验过程顺利，严格按照操作说明进行，出现与既往研究结论不一致可能与样本量较少有关，是否在Th细胞的反应中，有其他关键miRNA影响靶mRNA发挥作用尚不明确。本研究样本量少，单一基因表达诊断价值低，需联合其他miRNAs诊断。

1 Baumjohann D，Ansel KM.MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity〔J〕.Nat Rev Immunol，2013；13(9)：666-78.

2 Sullivan CS，Grundhoff AT，Tevethia S，etal.SV40-encoded microRNAs regulate viral gene expression and reduce susceptibility to cytotoxic T cells〔J〕.Nature，2005;435(7042)：682-6.

3 Mattes J，Collison A，Plank M，etal.Antagonism of microRNA-126 suppresses the effector function of Th2 cells and the development of allergic airways disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2009;106(44)：18704-9.

4 Ray A，Cohn L.Altering the Th1/ Th2 balance as a therapeutic strategy in asthmatic diseases 〔J〕.Curr Opin Investig Drugs，2000;1(4)：442-8.

5 Rautajoki KJ，Kylaniemi MK，Raghav SK，etal. An insight into molecular mechanisms of human T helper cell differentiation 〔J〕.Ann Med，2008;40(5)：322-35.

6 Mattes J，Yang M，Mahalingam S，etal.Intrinsic defect in T cell production of interleukin (IL)-13 in the absence of both IL-5 and eotaxin precludes the development of eosinophilia and airways hyper-reactivity in experimental asthma〔J〕.J Exp Med，2002;195(11)：1433-44.

7 Collison A，Herbert C，Siegle JS，etal.Altered expression of microRNA in the airway wall in chronic asthma：miR-126 as a potential therapeutic target 〔J〕.BMC Pulm Med,2011;11(1)：29.

8 Lu TX，Rothenberg ME.Diagnostic，functional，and therapeutic roles of microRNA in allergic diseases〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2013;132(1)：3-13.

9 史传见，吕玉敏，文 川，等.哮喘和慢性肺重叠综合征患者血清总IgE水平改变及其临床意义研究〔J〕.临床肺科杂志，2016；21(2)：283-5,286.

10 卢 兰，唐汉庆，窦锡彬，等.miRNA-126、TSLP在哮喘患者中的表达及影响〔J〕.医学信息，2014；(5)：67-8.

11 Schmittgen TD，Lee EJ，Jiang J，etal.Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA〔J〕.Methods，2008;44(1)：31-8.

〔2017-01-09修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

新疆医科大学科研创新基金项目(No.XYDCX201435)

黎 静(1963-)，女，副教授，主任医师,主要从事呼吸系统各类疾病的诊治，特别重视基础理论研究。

穆清爽(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌的诊治研究。

R56

A

1005-9202(2017)11-2730-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.057