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超声辅助酶法水解虾头蛋白工艺优化

2017-06-22苏玥段宙位夏光华卜浩桐张培吴谦申铉日

食品研究与开发 2017年12期
关键词:鱼翅解液木瓜

苏玥,段宙位,夏光华,卜浩桐,张培,吴谦,申铉日,*

(1.海南大学食品学院,海南海口570228;2.海南省农业科学院农产品加工设计研究所,海南海口571100)

超声辅助酶法水解虾头蛋白工艺优化

苏玥1,段宙位2,夏光华1,卜浩桐1,张培1,吴谦1,申铉日1,*

(1.海南大学食品学院,海南海口570228;2.海南省农业科学院农产品加工设计研究所,海南海口571100)

为提取虾头蛋白制备虾味调味品,提高虾头副产物的附加值,优化虾头酶解工艺。并探讨虾头酶解液在模拟鱼翅加工中的利用。通过超声波辅助木瓜蛋白酶法提取虾头蛋白,探讨超声功率、超声时间、粒径、酶解温度、pH值、料液比、酶添加量、酶解时间对虾头蛋白水解度的影响,通过响应面试验法优化提取工艺。通过向模拟鱼翅胶液中添加不同含量虾头酶解液的水溶液,探讨酶解液含量对模拟鱼翅感官的影响。超声波辅助酶法提取虾头蛋白的最佳提取条件为:按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g,粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头中添加木瓜蛋白酶,调节pH值至7.5,在超声功率120 W条件下处理20 min后,60℃下酶解时间3 h,此条件下虾头蛋白的水解率可达65.25%(以虾头蛋白质量计)。添加80%虾头酶解液制备的模拟鱼翅已具备较优的感官特性。

南美白对虾虾头;超声波;木瓜蛋白酶;模拟鱼翅

南美白对虾(Penaeus vannamei),又名万氏对虾,白对虾,隶属对虾科对虾属[1],具有抗逆性强、生长速度快,肉质鲜美等优点[2],在我国广泛养殖。据统计,2015年南美白对虾海水和淡水养殖量分别达到89.31万吨及73.16万吨[3]。目前我国的南美白对虾主要以冷冻去头形式出口,在此过程中产生的虾头、虾壳等副产物约占整虾质量的30%~40%,这些副产物除小部分用于生产饲料和制备甲壳素[4-5]外,绝大部分作为废弃物丢弃,造成资源浪费。因此,如何科学有效的利用虾头、虾壳等副产物,成为一个亟需解决的问题。

南美白对虾虾头含有丰富的蛋白质、甲壳素、还原糖、氨基酸、虾青素等[6-7]营养成分,具有潜在的应用价值。目前,国内围绕虾头的利用开展了一些研究,如刘素磊[8]等采用木瓜蛋白酶酶解法制备南美白对虾虾头调味汁;汤丹剑等[9]利用酶法制备虾头调味品;王尚豪[10]利用酶法制备虾味香精;孟绍凤[11]利用虾头制作风味基料,然而关于超声波辅助酶法结合酶法提取虾头蛋白的研究却少见相关报道。因此,本试验以虾头为原料,采用超声波辅助木瓜蛋白酶法提取其中的蛋白,探讨超声功率、酶解温度、pH值、料液比等因素对水解度的影响,通过响应面试验优化提取工艺,探讨不同酶解液添加量对于模拟鱼翅的改进效果,以期为虾头高值化利用提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻南美白对虾虾头:海南高远食品有限公司;木瓜蛋白酶(40 0000 U/g):南宁庞博生物工程有限公司;硼酸:广州化学试剂厂;酪蛋白:国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XO-5200DTD超声波清洗机:南京先欧仪器制造有限公司;HH-4数显恒温水浴锅:常州奥华仪器有限公司;TV-1900/TV-1901双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;组织捣碎机:美国Waring公司;THZ-22(82型)台式恒温振荡器:太仓市实验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 虾头预处理

将冷冻的大小均匀的虾头解冻、清洗、沥干,烘干(90℃),过筛,储藏,备用。

1.3.2 工艺流程

虾头→预处理→超声处理→酶法浸提→灭酶→过滤→取上清液测定吸光度→优化工艺→备用

1.3.3 虾头酶解液在模拟鱼翅中的应用

1.3.3.1 虾头酶解液的去腥处理

依照虾头酶解试验的最优优化条件进行制备。将收集好的酶解液浸泡在温度为30℃的水浴锅中,加入包有2%红茶和0.75%NaCl的纱布包,浸泡时间为180 min,进行脱腥处理[12]。

1.3.3.2 模拟鱼翅的制备

参考张雄[13]的试验及预试验,取9%的海藻酸钠与9%的明胶混合,在室温下分别用含有20%、40%、60%、80%、100%虾头酶解液的水溶液预溶胀1 h,然后在60℃下搅拌30 min,形成均匀胶液。使用针管将胶液缓慢挤压至0.6%的氯化钙溶液中使之成型,静置硬化90 min,取出用水洗净,对得到的鱼翅产品进行感官评价。

1.3.3.3 模拟鱼翅感官评价指标

感官评价由10人评定小组完成,选取实验室中对模拟鱼翅的制作和品质有一定经验的人员,评定开始前就试验目的、新产品特性和评分标准进行简短的培训。每个评价员独立完成对供试样品的评定,样品感官品质根据总得分确定。

表1 感官评分表Table 1 Sensory scoring of simulation shark fin

1.4 计算

1.4.1 总氮质量分数的测定

根据GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的方法,采用凯氏定氮法测定虾头总氮质量分数。

1.4.2 氨基酸态氮(AAN)质量分数的测定

根据GB/T 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》,采用甲醛电位滴定法测定酶解液中游离氨基酸含量。

AAN含量计算公式如下:

式中:X为样品中氨基酸态氮质量分数,g/g;m为酶解所加入的虾头粉质量,g;V0为样品中初始酸度所消耗的氢氧化钠体积,mL;V1为样品加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;V2为空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;C为氢氧化钠标准溶液的浓度,mol/L;0.014为与1.00 mL的1.000 mol/L NaOH标准溶液相当的氮的质量,g;50为样品的稀释倍数。

1.4.3 水解度的测定

蛋白质的水解度(DH)代表其在水解过程中肽键被裂解的程度[14]。其计算式为:

水解度/%=已水解的肽键数/原料中总肽键数× 100=(X1-X0)/(A-X0)×100

式中:A为原料中总氮质量分数,g/g;X1为水解液中氨基酸态氮质量分数,g/g;X0为原料中游离氨基酸态氮质量分数,g/g。

1.5 单因素试验设计

1.5.1 超声功率对虾头水解度的影响

取粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g添加木瓜蛋白酶,调节pH值至7.5,分别在超声功率48、72、96、120、144 W下处理20 min后,在60℃下酶解3 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.5.2 超声时间对虾头水解度的影响

取粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g添加木瓜蛋白酶,调节pH值至7.5,在超声功率120 W下分别处理0、15、20、25、30 min后,在60℃下酶解3 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.5.3 粒径对虾头水解度的影响

分别取粒径大小为小于0.2 mm、0.2 mm~0.3 mm、0.3 mm~0.45 mm、0.45 mm~0.9 mm、大于0.9 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g添加木瓜蛋白酶,调节pH值至7.5,在超声功率120 W下处理20 min后,在60℃下酶解3 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.5.4 酶解温度对虾头水解度的影响

分别取粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g添加木瓜蛋白酶,调节pH值至7.5,在超声功率120 W下处理20 min后,分别在30、40、50、60、70℃下酶解3 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.5.5 酶解pH值对虾头水解度的影响

分别取粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g添加木瓜蛋白酶,分别调节pH值至5.5、6.5、7.5、8.5、9.5,在超声功率120 W下处理20 min后,在60℃下酶解3 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.5.6 料液比对虾头水解度的影响

分别取粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL),酶添加量8 000 U/g添加木瓜蛋白酶,调节pH值7.5,在超声功率120 W下处理20 min后,在60℃下酶解3 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.5.7 酶添加量对虾头水解度的影响

分别取粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶10(g/mL),酶添加量分别为4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g添加木瓜蛋白酶,调节pH值7.5,在超声功率120 W下处理20 min后,在60℃下酶解3 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.5.8 酶解时间对虾头水解度的影响

分别取粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头粉0.5 g,按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g添加木瓜蛋白酶,调节pH值7.5,在超声功率120 W下处理20 min后,在60℃下分别酶解2、2.5、3、3.5、4 h,过滤,取上清液,测定水解度。

1.6 响应面试验设计

在单因素试验的基础上,选择超声时间、超声功率、酶解温度及酶解pH值为自变量,以水解度为响应值,根据Box-Behnken设计原理,采用四因素三水平响应面分析法进行试验设计,优化超声辅助酶法提取虾头蛋白水解液的提取工艺,因素与水平设计见表2。

表2 响应面分析法的因素和水平Table 2 Factors and levels used in response surface methodology

1.7 数据处理

采用Excel软件进行数据统计,所有数据均为3次重复试验的平均值,试验结果表现为均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对虾头水解度的影响

超声功率对虾头水解度的影响见图1。

图1 超声功率对虾头水解度的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on degree of hydrolysis of white shrimp head

由图1可知,随着功率的增高水解度先增高后降低,在120 W时取得最大值,这是因为超声功率增大,加快水的循环速度,强化传质,同时增加细胞的破碎程度,利于蛋白水解;功率过高,容器内瞬间快速升温,影响了木瓜蛋白酶的活性,水解度下降。超声功率选择120 W左右为宜。

2.1.2 超声时间对虾头水解度的影响

超声时间对虾头水解度的影响见图2。

图2 超声时间对虾头水解度的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on degree of hydrolysis of white shrimp head

由图2可知,随着超声时间的增加虾头水解度先增加后略有降低,在20 min时水解度取得最大值。这是因为当超声时间小于20 min时,由于超声波的空化作用[15],产生的气泡经挤压破裂,瞬间产生极强的机械剪切力,促进蛋白质降解,提高了水解效果;当超声时间大于20 min时,由于超声作用时释放的高温高压时间较长,形成较多自由基[16],攻击酶分子发生化学变化,降低酶活性,进而减缓蛋白的水解,降低了水解效果。超声时间选择20 min左右为宜。

经过超声波辅助酶提取虾头蛋白的提取率高于酶法提取虾头蛋白的提取率,这与吴素萍等[17]提取燕麦蛋白的效果类似;赵艳霞等[18]制备虾下脚料抗氧化肽的效果类似,说明适宜强度的超声处理,能有效提高虾头蛋白的水解度。

2.1.3 粒径对虾头水解度的影响

粒径对虾头水解度的影响见图3。

由图3可知,虾头蛋白水解度随着原料粒径的减小而增大,当粒径为0.2 mm~0.3 mm时,再减小粒径对水解度影响基本可以忽略。这是因为物料粒径越小,木瓜蛋白酶与底物的接触面积越大[17],可以更好地促进酶解反应,当粒径为0.2 mm~0.3 mm时,酶与底物已充分接触,减小粒径对虾头蛋白水解度影响不大。考虑到生产过程中的成本,粒径选择0.2 mm~0.3 mm为宜。

图3 粒径对虾头水解度的影响Fig.3 Effect of particle size on degree of hydrolysis of white shrimp head

2.1.4 酶解温度对虾头水解度的影响

酶解温度对虾头水解度的影响见图4。

图4 酶解温度对虾头水解度的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on degree of hydrolysis of white shrimp head

由图4可知随着酶解温度的增高,水解度先增高后降低,在60℃时达到最高。这是因为温度是影响酶活力的主要因素,酶在最适温度下活力最高,增加或降低温度均影响酶活力,木瓜蛋白酶酶解虾头蛋白的最适温度为60℃,此温度下酶活力最强,最利于虾头蛋白水解,这一结果与刘素磊[8]的试验结论近似。综上酶解温度选取60℃为宜。

2.1.5 pH值对虾头水解度的影响

pH值对虾头水解度的影响见图5。

由图5可知,随着pH值增加,水解度先增加后减小,pH值7.5时取得最大值。这是因为pH是影响酶活力的主要因素,酶在最适pH值下活力最高,木瓜蛋白酶水解虾头蛋白的最适pH值为7.5,此pH值下木瓜蛋白酶水解虾头能力最强,这一结果与陈丽花[14]等的试验结果相同。

图5 pH值对虾头水解度的影响Fig.5 Effect of enzymolysis pH on degree of hydrolysis of white shrimp head

2.1.6 料液比对虾头水解度的影响

料液比对虾头水解度的影响见图6。

图6 料液比对虾头水解度的影响Fig.6 Effect of ratio of material to water on degree of hydrolysis of white shrimp head

由图6可知,当料液比为1∶10(g/mL)时,随着液体量的减小虾头蛋白水解度逐渐减小;当料液比小于1∶10(g/mL)时,随着液体量的增大,底物浓度的减小对水解度影响不大。这是因为底物质量浓度过高,水解液黏度过大,影响酶的扩散,对酶解反应有抑制作用[19]。因此,料液比选择1∶10(g/mL)为宜。

2.1.7 酶添加量对虾头水解度的影响

酶添加量对虾头水解度的影响见图7。

图7可知,随着酶添加量的增加水解度先增高后略微降低。酶添加量对酶活的影响主要表现在两个方面:一方面,酶添加量较少时,增加酶添加量,提高酶与底物的结合效率,加快反应速率;另一方面,酶添加量过高时,酶与底物结合趋于饱和,虾头蛋白水解度变化不大,而酶添加量过高又会影响酶活性中心对底物的定位和接近[20],对酶活性产生一定的抑制作用,引起水解度略微下降。综上酶添加量选择8 000 U/g为宜。

图7 酶添加量对虾头水解度的影响Fig.7 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis of white shrimp head

2.1.8 酶解时间对虾头水解度的影响

酶解时间对虾头水解度的影响见图8。

图8 酶解时间对虾头水解度的影响Fig.8 Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis of white shrimp head

由图8可知,随着酶解时间的增长,虾头蛋白水解度先增高后趋于平衡,这是因为3 h时酶解反应完全,达到平衡,增加时间对虾头蛋白水解度影响不大。酶解时间为选择3 h为宜。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果及方差分析

响应面分析试验设计结果见表3。方差分析见表4。

表3 Box-Behnken试验设计与结果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

续表3 Box-Behnken试验设计与结果Continue table 3 Box-Behnken design with experimental results

运用Design-Expert 6.0软件进行二次多元回归拟合,得到二次多元回归方程:

由表4可知,此模型的P<0.000 1,响应面回归模型十分显著,失拟项(P=0.093 0>0.05)不显著,说明非试验因素对试验结果的影响不大。决定系数R2为0.97,这表明该模型与实际试验拟合较好,97%的响应值变化可以通过拟合模型进行解释。校正后的决定系数RAdj2为0.95,与R2接近,说明了模型有充分的准确性和通用性。因此该模型方程在试验范围内,能够适用于预测超声辅助酶法提取虾头蛋白水解液水解度的分析预测。从表4还可以看出,一次项A、B、C、D和二次项A2、B2、C2、D2对水解度影响极显著,交互项AB、AC、CD对水解度影响极显著,交互项AD对水解度影响显著;其他因素的影响不显著。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 响应面分析

各因素交互作用的响应面和等高线图结果见图9。

图9 各因素交互作用的响应面和等高线图Fig.9 Responsesurfaceandcontourplotsshowingtheeffectsofdifferentextractionparametersonthedegreeofhydrolsisofwhiteshimphead

图9能反映在试验范围内两因素的交互作用。超声时间与超声功率、超声时间与酶解温度、酶解温度与酶解pH值交互作用极显著,超声时间与酶解pH值对水解度影响显著。超声时间与其他因素具有显著影响,这可能是由于选定的超声功率较低,超声波对于酶结构的改变主要是通过长时间的作用显现出效果。而酶解时间与酶解pH值二者之间的相互作用关系也符合前人的研究。

2.3 最优提取工艺验证

通过模型预测超声辅助酶法提取虾头蛋白水解液的最优工艺条件为超声时间20.37 min、超声功率129.29 W、酶解温度58.08℃,酶解pH 7.38,蛋白水解率的预测值为66.784 8%。考虑到实际情况对上述条件进行修正,最终的优化条件为超声时间20 min、超声功率120 W、酶解温度60℃,酶解pH 7.5,在此条件下进行3次平行试验验证,水解度为(65.25±0.21)%,与理论预测值较接近,说明用该模型对虾头蛋白水解液的制备进行工艺优化具有一定的实际可操作性。

2.4 酶解液添加量对模拟鱼翅的影响

酶解液添加量对模拟鱼翅的影响见图10。

图10 酶解液梯度对模拟鱼翅感官值的影响Fig.10 Effect of enzymatic solution gradient on the sensory value of simulation shark fin

如图10所示,虾头酶解液含有大量的氨基酸,短肽等小分子物质,无法形成网状结构,对模拟鱼翅的凝胶结构几乎没有影响。所以,虾头酶解液主要通过鲜味的调节,对模拟鱼翅的感官值产生较大影响。随着酶解液含量的增高,模拟鱼翅的鲜味不断提高,导致感官值不断上升。在酶解液含量达80%时模拟鱼翅的感官值已达到较高值,与100%的添加量时的感官值差别较小,所得到模拟鱼翅具有较好的成型性、粗细均匀、表面光滑、无腥气苦味、具有较浓虾鲜味、口感爽滑、韧性较好。得到的较优模拟鱼翅产品与邓瑞群等[21]在最优混合胶液含海藻酸钠4.0%、明胶2.5%时,用0.3%的氯化钙作凝固剂制备的湿态仿鱼翅(感官值为64.37±0.31)进行对比,发现产品虽在透明度上有所下降,但成型性、滋味及口感方面均有较大的提高,具有更好的应用价值。

3 结论

以虾头为原料,水解度为评价指标,探讨超声功率、超声时间、粒径、酶解温度、pH值、料液比、酶添加量、酶解时间8个因素对虾头蛋白水解度的影响,在单因素基础上,通过响应面试验优化工艺。结果表明,超声波辅助木瓜蛋白酶提取虾头蛋白的最佳工艺条件为:按料液比1∶10(g/mL),酶添加量8 000 U/g,往粒径0.2 mm~0.3 mm的虾头中添加木瓜蛋白酶,调节pH值至7.5,在超声功率120 W条件下处理20 min后,60℃下酶解3 h,此条件下虾头蛋白的提取率可达65.25%(以虾头蛋白质量计),说明超声波辅助木瓜蛋白酶是提取虾头蛋白的一种有效途径。通过试验发现添加80%的虾头酶解液制备的模拟鱼翅已具备较优的感官特性,具有较好的成型性、粗细均匀、表面光滑、无腥气苦味、具有较浓虾鲜味、口感爽滑、韧性较好,为新型模拟鱼翅的开发提供了方向。

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Optimization of Hydrolyzation Technology of White Shrimp Head Protein by Enzyme Assisted Ultrasonic Treatment

SU Yue1,DUAN Zhou-wei2,XIA Guang-hua1,BU Hao-tong1,ZHANG Pei1,WU Qian1,SHEN Xuan-ri1,*(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,Hainan,China;2.Institute of Processing&Design of Agroproducts,Hainan Academy of Agricultural Science,Haikou 571100,Hainan,China)

In order to recover protein to product shrimp spices for explore added value of white shrimp head,the enzymatic hydrolysis process of the protein of white shrimp head was studied.And the use of shrimp head hydrolyzate in simulated shark fin processing was also studied.The white shrimp head powder was hydrolyzed with papain assisted by ultrasonic method,and the effects of ultrasonic power,ultrasonic time,particle size,enzymolysis temperature,enzymolysis pH,ratio of material to water,enzyme dosage(papain)as well as enzymolysis time on extraction rate of white shrimp head peptides were studied.The effect of the content of the hydrolyzate on the simulated shark fin was also studied by adding different solutions of the shrimp head hydrolyzate to the simulated shark fin glue.By single-factor experiment and Box-Behnken design experiment,the optimal extraction conditions were found as follows:ultrasonic power 120 W,ultrasonic time 20 min,particle size 0.2 mm-0.3 mm,enzymolysis temperature 60℃,enzymolysis pH 7.5,ratio of material to water 1∶10 g/mL,enzyme dosage(papain)8 000 U/g,enzymolysis time 3 h.Under these conditions,the extraction rate of white shrimp head peptides could a mount to 65.25% (to white shrimp head protein mass).The simulated shark fin prepared with 80%shrimp head hydrolyzate had better sensory characteristics.

white shrimp Penaeus vannamei head;ultrasonic;papain;simulation shark fin

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.011

2017-03-28

苏玥(1992—),男(汉),硕士研究生,研究方向:水产品贮藏及加工工程。

*通信作者:申铉日(1968—),男,教授,博士,研究方向:海洋生物资源利用、食品科学、组织工程学。

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