南美白对虾的冷藏特性及生物保鲜剂对腐败菌的抑制作用

吴佩君,唐树平,彭名军,马广智,汪光华,杨 喆,王静辉,黄儒强,*

(1.华南师范大学生命科学学院,广东广州510631;2.上海玖旭化妆品有限公司,上海201613;3.广州市食品检验所,广东广州510410)



南美白对虾的冷藏特性及生物保鲜剂对腐败菌的抑制作用

吴佩君1,唐树平2,彭名军3,马广智1,汪光华1,杨 喆1,王静辉1,黄儒强1,*

(1.华南师范大学生命科学学院,广东广州510631;2.上海玖旭化妆品有限公司,上海201613;3.广州市食品检验所,广东广州510410)

以感官评价、pH、菌落总数和挥发性盐基氮为测定指标,探究冷藏南美白对虾的货架期。为了提高南美白对虾冷藏期间的品质,用滤纸片法探究山棯子黄酮提取物、茶多酚、溶菌酶和Nisin对南美白对虾腐败菌的抑制效果,并用二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)。实验结果表明,在4 ℃条件下,整虾货架期为3 d;茶多酚对恶臭假单胞菌、腐败希瓦氏菌、藤黄微球菌、鲁氏不动杆菌和嗜水气单胞菌有抑制作用,MIC分别为0.12、016、0.06、0.18和0.14 g·100 mL-1;山棯子黄酮提取物可以抑制恶臭假单胞菌、腐败希瓦氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌和鲁氏不动杆菌,MIC分别0.40、0.50、0.20、0.90和0.40 g·100 mL-1。溶菌酶对蜡样芽胞杆菌、哥伦比亚肠球菌和藤黄微球菌有抑制作用,MIC分别为0.18、0.04和0.02 g·100 mL-1,Nisin可以抑制鲁氏不动杆菌、哥伦比亚肠球菌和藤黄微球菌,MIC分别为0.20、0.05和0.04 g·100 mL-1。综合来说,山棯子黄酮提取物和茶多酚可以抑制部分的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,而溶菌酶和Nisinz主要抑制革兰氏阳性菌。

南美白对虾,山棯子黄酮提取物,茶多酚,乳酸链球菌素,溶菌酶,抑菌

南美白对虾,学名凡纳滨对虾,壳薄体肥,肉质细嫩,蛋白质含量高,脂肪和碳水化合含量都极低,且富含微量元素,是膳食的理想食材[1]。南美白对虾在捕捞、加工和销售等环节中很容易受微生物侵染而腐败变质,并且虾头富含多酚氧化酶,加速氧化分解反应,导致虾体变软变黑,降低了南美白对虾的营养价值[2]。

表1 南美白对虾感官评分标准Table 1 Grading standard of Penaeus Vannamei sensory assessment

目前应用于南美白对虾保鲜的生物保鲜剂有茶多酚、溶菌酶、壳聚糖、乳酸链球菌和抗坏血酸等。茶多酚是一类多酚化合物,包括黄烷醇类、黄色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类。近年来的研究表明茶多酚具有抗氧化、清除自由基和抑制微生物生长等多种生理活性[3]。溶菌酶因其溶解细菌细胞壁而得名,其作用机理是切断N-乙酰壁酸和乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键,但是单独溶菌酶的防腐保鲜作用有一定的的局限性,主要表现在其特异性高,只能分解芽孢细菌的活细胞,而不能分解芽孢;只对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用,对革兰氏阴性菌几乎不起作用[4]。乳酸链球菌,缩写为Nisin,能有效杀死或者抑制引起食品腐败的革兰氏阳性菌,对产生孢子的细菌,如芽孢杆菌也有较强的抑制作用[5],但是在贮藏过程中,pH、温度等因素的改变也会影响Nisin的活性。

近年来,关于植物提取物的抑菌性研究报道越来越多,本实验室一直在研究山棯子黄酮提取物的抗氧化性、抗肿瘤性、降血脂等功能[6],但尚未涉及抑菌性研究,并且国内外关于山棯子黄酮提取物的抑菌性报道甚少,因此,本研究旨在比较通过比较山棯子黄酮提取物、茶多酚、溶菌酶和Nsin对南美白对虾腐败菌的抑制效果,为今后的复配保鲜剂提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾 购自广州市番禺区海鸥岛养殖技术研发基地;乳酸链球菌素(Nisin)(1200 U/g) 浙江银象生物技术有限公司;茶多酚(多酚≥98%) 成都艾科达化学试剂有限公司;溶菌酶(20000 U/mg) 美国Amresco公司;山棯子 市售;腐败希瓦氏菌、蜡样芽胞杆菌、鲁氏不动杆菌、藤黄微球菌、恶臭假单胞菌、嗜水气单胞菌、哥伦比亚肠球菌 均由华南师范大学生命科学学院325实验室筛选并保藏;营养肉汤、琼脂 广东环凯微生物科技有限公司;其它化学试剂 均为分析纯。

YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司;ZHJH-1109B超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司;SP-02Y生化培养箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司;PHS-3SpH计 上海大普仪器有限公司;K9840全自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 南美白对虾采样后加氧保活运到实验室,挑选鲜活、完整、色泽鲜亮、大小均一的个体,加冰猝死,流水洗净。随机分为8组,每组10头,置于保鲜盒中于4 ℃冷藏,每天取一组样品测定相关指标[7]。

1.2.2 山棯子黄酮类提取物的制备 取2000 g山棯子干燥粉碎,经70%乙醇浸提过滤浓缩后,上样于AB8大孔树脂,60%乙醇洗脱,旋转蒸发浓缩至膏状,真空干燥,称重定量,最终质量为100 g[8]。

1.2.3 南美白对虾贮藏特性

1.2.3.1 感官评定 由5名具有感官评定经验人员组成评定小组,按照表1对整虾的气味、外观和肉质3个方面进行评分,此表参照Reilly[9]加以调整,总分值在9分(极鲜)和0分(完全腐败)之间,6分以下表明样品已不可食用。

1.2.3.2 pH测定 称取2.00 g虾肉,用无菌研钵研磨,并置于试管中,加入18 mL灭菌蒸馏水,搅拌均匀静置10 min,过滤后用精密酸度计测定其pH。

1.2.3.3 菌落总数测定 根据食品安全国家标准GB 4789.2-2010[10]中食品微生物学检验菌落总数的测定方法测定,平行3次。

1.2.3.4 TVB-N含量测定 根据中国人民共和国水产行业标准SC/T 3032-2007[11]中水产品中挥发性盐基氮的测定方法测定。

1.2.4 山棯子黄酮提取物、茶多酚、Nisin和溶菌酶的抑菌效果测定 用滤纸片法探究Nisin、溶菌酶、山棯子黄酮提取物和茶多酚对冷藏南美白对虾腐败菌的抑菌效果。Nisin用pH为2～3柠檬酸配制出1 g/100 mL的母液,山棯子黄酮提取物、溶菌酶和茶多酚用蒸馏水分别配制成5、0.5、2 g/100 mL母液,用二倍稀释法探究其最小抑菌浓度(MIC)[12],以有抑菌圈形成的保鲜剂浓度作为依据,稀释成连续的5个浓度梯度,接入用生理盐水稀释而成的细菌浓度约为 5×105CFU/m L的菌悬液1 mL,120 r/min、30 ℃条件下振荡培养12 h,期间每隔2 h在600 nm波长处测定一次光密度值,每次均以无菌培养基为标准调零,观察光密度的变化,以OD值不变的最小浓度为该保鲜剂对该腐败菌的最小抑菌浓度。

1.3 数据处理

实验数据采用3次平行实验的平均值,数据间的差异性使用SPSS 19.0中的Duncan法进行方差分析和多重比较。结果采用平均值±标准偏差表示,数据曲线利用Origin Pro V8.5软件绘制。

2 结果与分析

2.1 南美白对虾贮藏特性的变化

2.1.1 感官评定 由图1可看出,随着贮藏时间的延长,整虾呈现出下降趋势。初始评分值为9分,虾体具有光泽,体节连接紧密,肌肉结实,有海虾固有的气味,冷藏1 d后,几乎没什么变化,但第4 d时,整虾的感官评分只有5.30分,虾头黑变严重,有异味,肉壳易分离,已腐败不能食用。贮藏期间,虾体内的微生物分解含氮及含硫大分子而产生挥发性盐基氮、三甲胺、硫化氢等腥臭物质,虾头的多酚氧化酶催化黑色素生成,使整虾变黑,影响整虾的外观[13]。

图1 南美白对虾贮藏期间感官评分的变化Fig.1 Changes in sensory score of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.1.2 pH测定 由图2可知,在0 d时,整虾的pH为7.12,冷藏1 d后,体内的糖原被降解,pH有所下降,但随后虾体内的蛋白质等物质被微生物分解成氨类物质,pH逐渐升高。

图2 南美白对虾贮藏期间pH变化Fig.2 Changes in pH of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.1.3 菌落总数测定 整虾菌落总数变化如图3所示,呈现先下降后上升的趋势,这是因为在冷藏期间,一些不耐寒细菌,繁殖较慢或者死亡,导致细菌总数下降,随后微生物开始大量繁殖,菌落总数逐渐上升。冷藏初期(0～2 d),菌落总数(cfu/g)≤105为一级鲜度,第3 d,菌落总数为5.28304 lg cfu/g,仍处于货架期,第4 d,菌落总数为6.36837 lg cfu/g≥106腐败已不能食用[14]。

图3 南美白对虾贮藏期间菌落总数的变化Fig.3 Changes in bacteria amount of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.1.4 TVB-N测定 由图4可知,随着冷藏天数的增加,TVB-N逐渐增大,在第4 d时整虾的TVB-N为34.88 mg/100 g,不在可接受范围之内。TVB-N是蛋白质在微生物和酶的作用下降解而产生的氨和胺类等碱性含氮物质的总称,是判断水产品腐败的指标之一。根据SC/T 3032-2007[11]规定,TVB-N(mg/100 g)≤25 处于一级鲜,TVB-N(mg/100 g)≤30在可接受范围之内。综合感官评定、pH、菌落总数和TVB-N这4个指标分析,南美白对虾的货架期为3 d。

图4 南美白对虾贮藏期间TVB-N的变化Fig.4 Changes in TVB-N of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.2 山棯子黄酮提取物、茶多酚、Nisin和溶菌酶的抑菌效果

由表2～表6可知,山棯子黄酮提取物、茶多酚、溶菌酶和Nisin对恶臭假单胞菌、嗜水气单胞菌、鲁氏不动杆菌、腐败希瓦氏菌、蜡样芽胞杆菌、哥伦比亚肠球菌和藤黄微球菌有一定的抑制作用。溶菌酶对蜡样芽胞杆菌、哥伦比亚肠球菌和藤黄微球菌有抑制作用,MIC分别为0.18、0.04和0.02 g·100 mL-1,Nisin可以抑制鲁氏不动杆菌、哥伦比亚肠球菌和藤黄微球菌,MIC分别为0.20、0.05和0.04 g·100 mL-1。据研究,Nisin通过与G+的细胞膜结合,插入、孔道形成等多步过程形成孔道复合物,从而引起细胞液的渗漏[15]。溶菌酶对革兰氏阴性菌几乎没无抑制作用,一是因为肽聚糖对溶菌酶很敏感,而G-的细胞壁主要成分不是肽聚糖,并且位于内层,不能与溶菌酶很快地直接接触。二是因为G-细菌特殊的细胞壁外层结构——脂质双层,具有屏障作用,能阻止多种物质透过[16]。茶多酚对恶臭假单胞菌、腐败希瓦氏菌、藤黄微球菌、鲁氏不动杆菌和嗜水气单胞菌的MIC分别为0.12、016、0.06、0.18和0.14 g·100 mL-1;山棯子黄酮提取物对恶臭假单胞菌、腐败希瓦氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌和鲁氏不动杆菌的MIC分别0.40、0.50、0.20、0.90和0.40 g·100 mL-1。茶多酚是儿茶素、黄酮和花色苷等一类物质的总称,关于茶多酚抑菌机理的相关报道较少,孙京新等人认为茶多酚处理假单胞菌能够逐步破坏其细胞壁的完整性,使得碱性磷酸酶渗出,继而破坏细胞膜的完整性[17],而山棯子黄酮类提取物,其分子结构上有较多的酚羟基,这些官能团与蛋白质或酶通过氢键方式结合,导致细胞质的固缩和解体[18]。

表2 山棯子黄酮提取物对腐败菌的抑菌圈直径(mm)Table 2 The inhibition zone of flavonoids extracts of Fructus rhdomyrti to spoilage bacteria(mm)

注:“-”表示无抑制效果;表3～表6同。

表3 茶多酚对腐败菌的抑菌圈直径(mm)Table 3 The inhibition zone of tea polyphenols to spoilage bacteria(mm)

表4 Nisin对腐败菌的抑菌圈直径(mm)Table 4 The inhibition zone of Nisin to spoilage bacteria(mm)

表5 溶菌酶对腐败菌的抑菌圈直径(mm)Table 5 The inhibition zone of lysozyme to spoilage bacteria(mm)

表6 生物保鲜剂对腐败菌的最小抑菌浓度(g·100 mL-1)Table 6 The MIC of biological preservative to spoilage bacteria(g·100 mL-1)

3 结论

通过实验探究,在4 ℃条件下,南美白对虾的货架期为3 d,这与徐丽敏[19]的研究结果相近,货架期的长短与对虾生活的环境有密切的联系,初始菌落数目及细菌种类等因素都会影响对虾的品质。茶多酚对恶臭假单胞菌、腐败希瓦氏菌、藤黄微球菌、鲁氏不动杆菌和嗜水气单胞菌有抑制作用,MIC分别为0.12、016、0.06、0.18和0.14 g·100 mL-1;山棯子黄酮提取物可以抑制恶臭假单胞菌、腐败希瓦氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌和鲁氏不动杆菌,MIC分别0.40、0.50、0.20、0.90和0.40 g·100 mL-1。溶菌酶对蜡样芽胞杆菌、哥伦比亚肠球菌和藤黄微球菌有抑制作用,MIC分别为0.18、0.04和0.02 g·100 mL-1,Nisin可以抑制鲁氏不动杆菌、哥伦比亚肠球菌和藤黄微球菌,MIC分别为0.20、0.05和0.04 g·100 mL-1。综合来说,Nisin和溶菌酶对革兰氏阴性菌几乎无抑制作用,但对革兰氏阳性菌有很好的抑制效果;山棯子黄酮提取和茶多酚的抑菌谱相似,都能抑制部分的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,且抑菌效果较好。山棯子作为中国比较常见的植物,抗逆性强,价格低廉,易栽培,易分离提纯,将其发展为一种天然的抑菌剂和保鲜剂具有实际应用价值。

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Refrigerated characteristics ofPenaeusVannameiand effects of biological preservatives against the spoilage bacteria

WU Pei-jun1,TANG Shu-ping2,PENG Ming-jun3,MA Guang-zhi1, WANG Guang-hua1,YANG Zhe1,WANG Jing-hui1,HUANG Ru-qiang1,*

(1.College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou 510631,China; 2.Shanghai Joies Cosmetics Co.,Ltd.,Shanghai 201613,China; 3.Guangzhou Institute for Food Control,Guangzhou 510410,China)

In order to evaluate the shelf life ofPenaeusVannamei,sensory evaluation,pH,total bacteria count(TVC)and total volatile basic nitrogen(TVB-N)were determined. Using the method of paper disc to determine the antibacterial activity of Fructus rhdomyrti, tea polyphenols,lysozyme and Nisin to the spoilage bacteria ofPenaeusVannamei. Then fold dilution method was used to determine different preservative’s MIC of different spoilage bacteria. Results showed that the self life of shrimp was 3 d under 4 ℃. Tea polyphenols can inhibitPseudomonasputida,Shewanellaputrefaciens,Micrococcusluteus,AcinetobacterlwoffiiandAeromonashydrophilia. The MIC of tea polyphenols to these spoilage bacteria were 0.12,016,0.06,0.18 and 0.14 g·100 mL-1. flavonoids extracts ofFructusrhdomyrtican inhibitPseudomonasputida,Shewanellaputrefaciens,Micrococcusluteus,BacilluscereusandAcinetobacterlwoffii. The MIC of Fructus rhdomyrti to these spoilage bacteria were 0.40,0.50,0.20,0.90 and 0.40 g·100 mL-1. The MIC of lysozyme toBacilluscereus,ColumbiaenterococcusandMicrococcusluteuswere 0.18,0.04 and 0.02 g·100 mL-1. The MIC of Nisin toAcinetobacterlwoffii,ColumbiaenterococcusandMicrococcusluteuswere 0.20,0.05 and 0.04 g·100 mL-1. To summarize,tea polyphenol and flavonoids extracts of Fructus rhdomyrti can inhibit part of G+and G-when Nisin and lysozyme mainly inhibit the G+.

PenaeusVannamei;flavonoids extracts ofFructusrhdomyrti;tea polyphenol;Nisin;lysozyme;antibacterial

2016-11-28

吴佩君(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学，E-mail：1264414436@qq.com。

*通讯作者:黄儒强(1968-)，男，博士，教授级高级工程师，研究方向：食品生物技术、微生物与生化药学，E-mail：qiangdoctor@126.com。

广州市产学研协同创新重大专项(201604020068)。

TS254.4

A

1002-0306(2017)10-0341-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.057