响应面法优化止泻木子总生物碱的提取工艺

陈效威,杨中铎,孙建慧,赵俊文,朱保应

(兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730050)



响应面法优化止泻木子总生物碱的提取工艺

陈效威,杨中铎*,孙建慧,赵俊文,朱保应

(兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730050)

本文对止泻木种子中总生物碱的提取工艺进行优化。在单因素实验的基础上,通过四因素三水平进行响应面设计实验,以总生物碱得率为响应值进行响应面分析,优化总生物碱的提取工艺参数。结果表明各因素对止泻木子中总生物碱提取得率的影响顺序依次为:提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比。止泻木子中生物碱的最佳提取工艺为乙醇浓度85%、提取时间3 h、料液比1∶10、提取温度80 ℃。此条件下,止泻木子中总生物碱的含量为(23.8±0.12) mg/g。此方法可靠,提取率高,适于止泻木中的总生物碱提取。

止泻木,响应面,总生物碱,提取

止泻木(HolarrhenaantidysentericaWall. ex A. DC.)藏名:毒毛妞，属于夹竹桃科夹竹桃亚科。主要分布在云南西双版纳、广东、台湾以及印度等亚洲南部的一些国家,喜好海拔1000 m以下的山地疏林或密林水沟地带[1]。在我国,止泻木生长在青藏高原、内蒙古和新疆等地区。性味苦,性凉,其药理活性广泛,包括清热解毒,清血热,利胆,止泻,镇痛等;可治疗肝胆病,胃肠热病,腹泻,痢疾等[2-4]。止泻木子中含有锥丝碱(conessine)、降锥丝碱(norconessine)、锥丝明(conessimine)、异锥丝明(isoconessimine)、止泻木明(holarrhimine)、止泻木碱(holarrhine)、锥丝亚胺(coni-mine)等生物碱[5]。这些生物碱具有杀原虫的作用,对于治疗阿米巴性痢疾、杀阿米巴原虫效果非常明显;其次对心血管系统尤其是心脏有保护作用。其他作用包括具局麻作用以及抑制消化酶的分泌等药用价值[6-8]。

但现有文献对止泻木子中总生物碱的提取工艺优化研究鲜有报道。根据姜月蒙和肖娟等[9-10]运用响应面法优化总生物碱提取工艺的设计思路，本研究以止泻木子为原料,确定其止泻木子生物碱提取的最佳工艺,并利用最佳提取方法提取止泻木子生物碱，以期为止泻木植物的综合利用及从止泻木子中获得高活性的乙酰胆碱酯酶抑制剂生物碱衍生物进一步研究奠定基础[11]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

药材止泻木干燥种子 购买于青海省西宁市八一中路90号药材市场,由兰州理工大学生命科学与工程学院植物分类专业的杨林副教授鉴定;甲醇、氯仿、丙酮等常用试剂 均为分析纯;乙醇 工业试剂;甲基红 购自阿拉丁试剂，上海晶纯生化科技股份有限公司;硫酸、盐酸、氢氧化钠 购自上海化学试剂厂;邻苯二甲酸氢钾 购于成都化学试剂厂。

AB-105电子天平 Mettler Toledo Group;HH-2数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;DFT系列手提式高速粉碎机 上海隆拓仪器设备有限公司;SHB-IIIA循环水式多用真空泵 长城科工贸有限公司;RE-52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DL-3005低温循环水浴 江苏金坛市医疗器械厂;KQ-250 DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 止泻木子总生物碱的提取 取一定量止泻木子粉碎并过60目筛,准确称取止泻木子粉末5 g装入250 mL圆底烧瓶中,然后用50 mL 90%乙醇80 ℃回流提取3 h,过滤并浓缩。将所得固形物用水溶解,然后转入1 L烧杯中,用4 mol/L HCl 调pH至2,静止过夜后过滤,将滤液再用4 mol/L NaOH 调pH至11并转入分液漏斗中,然后再用等体积的氯仿萃取3次,减压浓缩,得止泻木子总生物碱。

1.2.2 总生物碱的测定 总生物碱加中性乙醇5 mL溶解,再精密加入15 mL标准硫酸滴定液(0.01 mol/mL),水15 mL及甲基红指示液2滴,摇匀,以0.02 mol/L标准氢氧化钠滴定液回滴,滴定终点溶液由红色变黄色,求出每份样品消耗的硫酸滴定液的量,通过硫酸消耗量评价提取效果,此方法所消耗硫酸量越多表示生物碱含量越多[12]。对提取的总生物碱进行准确称取关计算产率。

1.2.3 提取工艺单因素实验 采用1.2.1下提取止泻木子总生物碱的方法。固定1.2.1其他条件,分别考察乙醇浓度(55%、65%、75%、85%、95%)、提取时间(1、2、3、4、5 h)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 g/mL)、提取温度(50、60、70、80、90 ℃),对硫酸消耗量的影响。

1.2.4 响应面设计实验 根据单因素的实验结果和Box-Behnken实验设计原理,选取影响止泻木子中总生物碱提取效果的主要因素乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度,对这四因素三水平进行响应面设计实验,以硫酸的消耗量为响应值,各因素的三水平采用-1、0、1进行编码,如表1。

表1 响应面设计水平和编码Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对生物碱提取的影响 由图1可知,随着乙醇浓度的增高，总生物碱的提取量也在逐步增大,但是当乙醇浓度达85%后生物碱提取量开始下降,这是因为当乙醇浓度超过90%时水溶性杂质如多糖、蛋白质提出,会干扰生物碱的提取,使提取效果下降[13]。故将提取的乙醇浓度定为85%左右。

图1 乙醇浓度对总生物碱提取效果的影响Fig.1 Effect of Ethanol concentration on the extraction efficiency of total alkaloids

2.1.2 料液比对生物碱提取的影响 由图2可知,随着料液比的增大生物碱的含量逐步升高,但是当料液比为1∶10 g/mL时止泻木子中的生物碱基本溶出,再增加溶剂的量,无明显变化,还会给后续的工艺增加困难,通过对实际生产效益和节省原料考虑,将料液比1∶10 g/mL确定为提取条件。

图2 料液比对总生物碱提取效果的影响Fig.2 Effect of ratio of matedal-to-solven on the extraction efficiency of total alkaloids

2.1.3 提取时间对生物碱提取的影响 由图3可知,在0～3 h范围内,随着时间的增长生物碱的提取率加大,这可能是因为延长提取时间有利于药材粉末和提取溶剂的充分接触,但是到3 h后提取率增加缓慢,这可能是因为时间过短,生物碱还未充分溶出,若时间继续延长时,提取液内的有效成分溶解已达到平衡,提取率不会再加大,故提取时间为3 h左右。

图3 提取时间对总生物碱提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of total alkaloids

2.1.4 提取温度对生物碱提取的影响 由图4可知,随着提取温度的增高,生物碱的提取率也随之增大,这是因为温度的升高,液体黏度下降,分子运动加快,加快溶质的扩散和溶剂的渗透,有利于生物碱的溶出,当温度超过80 ℃时提取率又开始逐渐下降,因此,将提取温度定为80 ℃左右。

图4 提取温度对总生物碱提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of total alkaloids

2.2 响应面实验结果分析

2.2.1 模型的建立及显著性实验 根据表2的结果,Design-Exper8.0软件对表3中的实验数据进行多元化拟合回归,得回归方程:

Y=+2.62+0.40A+0.16B+0.35C+0.41D+0.016AB-0.33AC+0.011AD-0.59BC+0.27BD+0.22CD-0.43A2-0.47B2-0.49C2-0.37D2。模型系数显著性结果和方差分析结果见表3。

表2 止泻木子生物碱响应面分析方案及实验结果Table 2 Response surface design matrix with experimental and predicted values of total alkaloid content of Holarrhena antidysenteriaca

表3 回归统计分析表Table 3 ANOVA for the response surface regression model

注:**p<0.01差异极显著;*p<0.05差异显著。

2.2.2 响应面图分析 利用 Design-Exper8.0软件对表3数据进行二次回归多元拟合,所得到的二次回归方程的响应面图见图5。

图5 两因素交互作用对止泻木总生物碱得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for the effects of process paranleters on the extraction efficiency oftotal alkaloids from Holarrhena antidysenteriaca

3 结论

综合单因素和响应面设计实验的结果,得出止泻木子中总生物碱的最佳提取工艺为：药材粉碎粒度60目,乙醇浓度85%、提取时间3 h、液料比1∶10 g/mL、提取温度80 ℃,此条件下,得止泻木子中总生物碱含量为(23.8±0.12) mg/g。用响应面对止泻木子中总生物碱提取工艺进行优化,科学合理,准确可靠,而且总生物碱是止泻木子中重要的功效物质,其提取工艺为止泻木子各功效物质的进一步研究奠定了基础。

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[5]安鲁斯,塔娜,娜仁其木格. 蒙药止泻木-4汤治疗儿童细菌性肠炎的临床疗效观察[J].中国民族医药杂志,2015,21(7):11-12.

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该图形直观地给出了各因素交互作用响应面的3维图,从响应面的最高点可以看出,在所选范围内存在极值。从响应面曲面坡度的陡峭程度和等高线图可以看出因素间交互作用的强弱和因素对响应值的影响程度。图5表明BD提取时间和提取温度的交互作用、DC提取时间和提取温度的交互作用、AC乙醇浓度和提取温度的交互作用、BC液料比和提取温度的交互作用较显著。以图5提取时间和液料比的交互作用为例说明,在乙醇浓度3.41 h、液料比1∶10.16 g/mL的条件下,止泻木子中总生物碱含量随提取温度的增加先增加后减小,亦随提取时间的增大先增加后减小。其他各图依此分析,其分析结果与单因素实验结果基本一致。

2.2.3 提取最佳工艺优化 由Design. Exper 8.0软件分析得到止泻木子中总生物碱最佳提取工艺条件。最佳工艺条件为乙醇浓度85.04%、提取时间3.41 h、液料比1∶10.16 g/mL、提取温度80.35 ℃,在此条件下提取总生物碱,硫酸消耗量为2.71 mL,总生物碱的含量可达23.5 mg/g。进行验证实验,乙醇浓度85%、提取时间3 h、液料比1∶10 g/mL、提取温度80 ℃,此条件下,止泻木子中总生物碱的含量为(23.8±0.12) mg/g,与理论值较为吻合,表明优选工艺提取效果较为理想。

Optimization of extraction process for total alkaloids fromHolarrhenaantidysenteriacaby response surface methodology

CHEN Xiao-wei,YANG Zhong-duo*,SUN Jian-hui,ZHAO Jun-wen,ZHU Bao-ying

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

The extraction of total alkaloids fromHolarrhenaantidysenteriacawas optimized.Single factor experiment was employed to identify four main process parameters.The selected variables were optimized by response surface analysis based on the extraction yield of total alkaloids.The results showed that the effect of the investigated factors on the total alkaloids extraction yield was in the order as:extraction temperature>ethanol concentration>extraction time>matedal-to-solven ratio.The optimal extraction parameters were 85% ethanol and subsequent extraction at 80 ℃for 3 h with a matedal-to-solven ratio 1∶10 g/mL. The extraction yield of total alkaloids obtained was(23.8±0.12) mg/g under these conditions.This described method was reliable.Highly extraction and suitable for the extraction of total alkaloids fromHolarrhenaantidysenteriaca.

Holarrhenaantidysenteriaca;response surface;alkaloids;extraction

2016-11-01

陈效威(1989-)，男，硕士研究生，主要从事天然药物化学方面的研究，E-mail:chenxw8912@.126.com。

*通讯作者:杨中铎(1976-)，男，博士，教授，主要从事天然药物化学方面的研究，E-mail:yangzhongduo@126.com。

国家自然科学基金项目(21262022)；兰州市科技局医药专项(2014-1-151)；甘肃省科技厅科技支撑计划项目(1604FKCA084)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0253-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.040