模拟缫丝废水中丝胶蛋白的树脂吸附分离

焦瑞婷,江虹锐,王成华,赵谋明,刘小玲

(广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004)



模拟缫丝废水中丝胶蛋白的树脂吸附分离

焦瑞婷,江虹锐,王成华,赵谋明,刘小玲*

(广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004)

本文比较AB-8、LX-1180、D101、DA201-C、DEAE-52、201×7 六种树脂对模拟缫丝废水中丝胶蛋白的静态吸附和解析性能,筛选出适宜分离纯化丝胶蛋白的树脂,并通过静态和动态洗脱实验确定最佳工艺参数。结果表明:DEAE-52型离子交换树脂吸附解析效果最好,吸附量为1.573 mg/g,吸附率可达到95.07%。柱分离时,丝胶废液以5 BV/h流入分离柱;采用pH2的0.05 mol/L的氯化钠溶液以2 BV/h洗脱4 BV,收集1.7～3.0 BV洗脱流分,洗脱率98.76%,经吸附分离,丝胶蛋白浓缩倍数达到16.33,收集所得丝胶蛋白的回收率和纯度分别可达95.26%和96.71%。

缫丝废水,丝胶蛋白,树脂,吸附

蚕丝是一种重要的天然蛋白质纤维,由70%～80%丝素蛋白、20%～30%丝胶蛋白及少量蜡质及无机物组成[1]。丝胶蛋白含有丝氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸等人体所需的18种氨基酸[2],具有良好的抗氧化性[3]、抗紫外线[4]、吸湿及抗菌性等优点[5-6],并广泛应用于医药[7-8]、化妆品[9-10]、生物材料[11-13]、纺织[14]、食品[15]等领域。然而,蚕丝中的丝胶组分却在丝绸生产过程中随废水排放,未能有效利用。有资料表明,每年中国生产生丝6万吨,其中约2万～3万吨的丝胶随废水排放,使废水的浊度、化学需氧量(COD)值和生化需氧量(BOD)值增加,不仅造成严重的环境污染,也是对资源的极大浪费,不符合绿色环保和可持续发展战略的要求[16],亟需对丝胶成分进行回收利用。

目前缫丝工业的脱胶方法主要采用热水煮茧及热碱水缫丝抽丝等方法。因此,脱胶废液pH呈中性或碱性。从废水中回收提纯丝胶的方法主要有酸析法、化学混凝法、有机溶剂沉淀法、离心法、冰冻法、超滤法等[17-18],但这些方法存在回收产物毒性高、回收率低、成本高等不足。与上述方法相比,树脂法具有成本低、设备简单、不用或少用有机溶剂、易于工业放大等优点。利用废水丝胶蛋白在不同pH时的带电性的差异,可选择适当的极性大孔吸附树脂或离子交换树脂,通过离子键或静电相互作用将丝胶蛋白吸附到树脂中,再通过改变离子强度或溶液的酸碱性使吸附的丝胶蛋白解析,从低浓度的缫丝废液富集回收得到较高浓度的丝胶蛋白。本文以广西宜州缫丝废水为典型废液,在实验室自制脱胶废液,以此模拟工业废液来探寻适宜的树脂和吸附分离条件,为缫丝废水中的丝胶蛋白分离及利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑蚕茧 广西宜州市七叶种植专业合作社;缫丝废水 广西宜州市宏基茧丝有限公司;DEAE-52树脂 北京索莱宝科技有限公司;AB-8、LX-1180、D101、DA201-C、DEAE-52、201×7树脂 陕西博晖生化科技有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸等 均为国产分析纯。

UV-6100紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;GZX-GF101电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模拟缫丝废水制备 蚕茧先进行选剥、剪碎,取6 g蚕茧加入600 mL水,在100 ℃条件下水煮45 min,沥去不可溶丝素,并将水煮液稀释6倍后得到模拟缫丝废液。该废液中丝胶蛋白的含量为0.414 mg/mL,pH7.94,电导率为1.512 ms/cm,与广西宜州宏基茧丝有限公司采样废水组成一致,可用于后续废水丝胶蛋白回收实验。

1.2.2 溶液中丝胶蛋白含量的测定 按照文献[19]的方法稍加改动,取2 mL样品于280 nm处测定其吸光度值(A),代入预先测定的丝胶蛋白标准曲线A=0.5983C+0.0053,相关系数R2=0.9999,可计算其中丝胶蛋白的含量(mg/mL)。

1.2.3 树脂预处理 AB-8、D101、DA201-C树脂的预处理:先用95%乙醇浸泡 24 h,冲洗干净后再用1 mol/L盐酸溶液浸泡3 h,用水洗至中性后,再用1 mol/L NaOH溶液浸泡3 h,用蒸馏水洗至中性,备用。DEAE-52、201×7树脂预处理:先用蒸馏水浸泡,后续的酸洗和碱洗参照上述步骤。

LX-1180树脂预处理:先用95%乙醇浸泡24 h。用蒸馏水冲洗树脂至乙醇无残留,浸泡于蒸馏水中,备用。

1.2.4 树脂选型 称取已处理好的干燥树脂约5 g,置250 mL具塞锥形瓶中,加入100 mL模拟废水,在25 ℃、150 r/min条件下振荡,每隔一定时间取2 mL废水测定吸光度OD280,绘制丝胶蛋白的静态吸附曲线[20]。24 h后测定废水中蛋白质含量,按照下列公式计算树脂的吸附量和吸附率[21-22]。

式中:C1为吸附前废水中丝胶蛋白浓度(mg/mL);C2为吸附后废水中丝胶蛋白浓度(mg/mL);W为树脂干重(g);V为溶液体积(mL)。

将吸附饱和的树脂取出吸干表面的水分,精确加入100 mL相应的洗脱剂(AB-8、DA201-C、D101、LX-1180使用75%乙醇,201×7使用0.5 mol/L 氢氧化钠溶液,DEAE-52使用0.4 mol/L氯化钠溶液作为解析液),25 ℃下150 r/min摇荡24 h,过滤,测定此时解吸液中丝胶蛋白的含量,并按照下列公式计算解吸率[23]。

式中:C为解吸液中丝胶蛋白的含量(mg/mL);V1为解吸液体积(mL);M为树脂干重(g);Q为吸附量(mg/g)。

1.2.5 影响树脂解析因素的研究 取5g吸附饱和的DEAE-52树脂,加入100mL洗脱液(pH2,0.1mol/L氯化钠溶液),25 ℃条件下150r/min摇荡,分别在15、30、60、90、120、150min取2mL测定解析液中丝胶蛋白含量,绘制解析曲线。

配制不同pH酸碱溶液(2、3、4、5、6、7、8、9)作为洗脱液,按照上述洗脱流程对5g吸附饱和的DEAE-52树脂进行洗脱,考察不同pH酸碱溶液对树脂解析能力的影响。

配制不同浓度的氯化钠溶液(0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L)作为洗脱液,按照上述洗脱流程对5g吸附饱和的DEAE-52树脂进行洗脱,考察不同浓度的氯化钠溶液对树脂解析能力的影响。

分别配制pH2和pH3的不同浓度氯化钠溶液(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L)作为洗脱液,按照上述洗脱流程对5g吸附饱和的DEAE-52树脂进行洗脱,考察pH与氯化钠溶液组合对树脂解析能力的影响。

1.2.6DEAE-52树脂动态吸附解析

1.2.6.1 上样速率的确定 取已预处理好的DEAE-52树脂9.259g,进行湿法装柱(柱体积为25mL),待装好柱后,丝胶蛋白废水以不同速率(3.0,5.0,7.5BV/h)上柱,收集经过柱子的流出液,测定流出液中丝胶蛋白的浓度,计算吸附量及吸附率,从而确定最佳的上样速率。

1.2.6.2 树脂柱层析动态洗脱条件优化 当分离柱树脂达到吸附饱和后,以2BV/h流速,用1BV去离子水洗脱,再分别用pH3,0.1mol/L氯化钠和pH2,0.05mol/L氯化钠两种洗脱剂洗脱,每0.1BV(2.5mL)收集一管,分别测定洗脱液中丝胶蛋白含量,绘制动态洗脱曲线。

1.2.6.3 洗脱速率的确定 取相同量的DEAE-52树脂湿法装柱,上样饱和后,分别用选定洗脱剂以不同洗脱速度(设定为1.0、2.0、3.0BV/h)进行洗脱。0.1BV收集一管,测定洗脱物中丝胶含量随洗脱速率的变化。收集一定体积的洗脱液,55 ℃烘箱中干燥至恒重,测定其洗脱物中丝胶蛋白的回收率及纯度。丝胶蛋白纯度、回收率及浓缩比的计算公式如下:

丝胶蛋白的纯度(%)=丝胶蛋白的浓度(mg/mL)×溶液体积(mL)/洗脱物的质量(mg)×100

丝胶蛋白回收率(%)=过柱后丝胶蛋白质量(mg)/过柱前丝胶蛋白质量(mg)×100

浓缩比=收集洗脱液中丝胶蛋白的浓度(mg/mL)/上样液中丝胶蛋白的浓度(mg/mL)

1.2.7 数据处理 每组实验做3次平行,使用SPSS18.0进行数据分析,置信度95%(α=0.05);使用Origin7.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 树脂选型

2.1.1 树脂的吸附动力学曲线 静态下树脂对丝胶蛋白的吸附随时间变化如图1所示。60 min内,废水的吸光度值呈快速下降,并在60 min时基本达到稳定。相比6种树脂,离子交换树脂DEAE-52的吸附速率最快,30 min时已基本达到饱和,且废液吸光度变化程度最大,说明DEAE-52吸附量大,为快速吸附型。而大孔树脂D101、LX-1180、AB-8、DA201-C等则在120 min达到平衡,且对丝胶蛋白的吸附量很低。

图1 丝胶蛋白树脂的静态吸附曲线Fig.1 Adsorption curves of sericin in six resins

2.1.2 不同型号树脂对丝胶蛋白的静态吸附和解析比较 经24 h吸附饱和后,不同树脂在其建议洗脱剂下洗脱,得到其吸附和解析量如表1所示。由表1可见,离子交换树脂201×7 和DEAE-52的吸附量较高,其中,DEAE-52的吸附量最高,达到1.573 mg/g,比最低的D101高近6倍,但其解析率仅为80.39%,比201×7低,而DEAE-52树脂对丝胶蛋白的吸附和解析率都在80%以上。因此,综合考虑,选用DEAE-52树脂作为后续实验的分离树脂。

表1 树脂对丝胶蛋白的吸附和解析比较(25 ℃)Table 1 Comparison of adsorption and desorption of sericin for resin(25 ℃)

注:同一列不同字母表示存在显著性差异,p<0.05;表2、表3同。

2.2 影响树脂解析因素的研究

2.2.1 pH对解析能力的影响 图2是解析液pH对DEAE-52树脂吸附丝胶蛋白解析能力的影响,从图2可以看出,随着时间延长,丝胶的解析率逐渐增大,在前15 min快速达到吸附平衡,15 min以后基本没有明显提高。解析液pH为2和3时,丝胶蛋白解析率显著高于其他pH。pH2酸性水溶液对DEAE-52吸附丝胶蛋白的解析率最大为60.40%,原因可能是随着解析液酸性的增加,丝胶蛋白逐渐转变成带正电荷的蛋白质,与阴离子交换纤维上的正电荷产生静电排斥作用,使得丝胶蛋白能充分解析[24]。

图2 pH对丝胶蛋白DEAE-52解析能力的影响Fig.2 The effect of pH on the desorption of sericin from DEAE-52 resin

2.2.2 盐浓度对解析能力的影响 吸附饱和的DEAE-52树脂在不同浓度的氯化钠解析液中,丝胶蛋白解析率随时间的变化见图3。从图3可以看出,DEAE-52属于快速解析型树脂。

氯化钠浓度为0.1 mol/L时,丝胶蛋白的解析率最大为73.80%,而其浓度达到0.8 mol/L以上时,解析率显著降低。介于0.1～0.8 mol/L之间时,解析率随氯化钠浓度的增大出现一定的波动,总体趋势为降低。可能原因是盐浓度对蛋白质的盐析效应和盐溶效应之间的变化,从而导致解析率改变[25]。

图3 氯化钠浓度对DEAE-52树脂吸附丝胶蛋白解析能力的影响Fig.3 Effect of concentration of NaCl on the elution ability of DEAE-52 resin

2.2.3 pH与盐的联合作用 调整氯化钠溶液的pH,探讨酸性氯化钠浓度对DEAE-52吸附解析能力的影响如图4所示。从图4可知洗脱液pH为2时,丝胶蛋白的解析率随氯化钠浓度增加而逐渐增大,离子浓度为1.0 mol/L和0.05 mol/L时的解析率较高,分别为88.99%和86.08%,无显著差异(p>0.05)。当洗脱液为pH3的0.1 mol/L氯化钠溶液时,解析率最大为93.67%。这一结果与代菊红[26]使用DEAE-52离子交换树脂吸附分离重组类人胶原蛋白Ⅰ,用pH6.0,0.3 mol/L的氯化钠溶液的脱附率为93%的结果相似。无论洗脱液的pH为2或pH为3时,洗脱液在很低的离子浓度下对树脂吸附的丝胶蛋白都可以达到较好的解析效果,从环保和成本的角度拟采用pH3,氯化钠浓度为0.1 mol/L作为洗脱液。

图4 氯化钠浓度与pH协同对树脂DEAE-52解析能力的影响Fig.4 Effect of NaCl concentration & pH on desorption ability of DEAE-52 resin

2.3 DEAE-52树脂动态吸附解析

2.3.1 上样速率对树脂吸附能力的影响 上样速率低时,树脂与废水充分接触从而使废水中丝胶蛋白的吸附量和吸附率都比较高。若上样速率过快,废水中的丝胶蛋白和树脂未充分接触已经流过树脂,造成树脂的吸附能力下降。从表2可以看出上样速率为5 BV/h时树脂的吸附量和吸附率都较高,并且此时速率适中,即有利于树脂吸附废水中的丝胶蛋白,又节省时间,综合考虑确定废水的上样速率为5 BV/h。

表2 上样速率对树脂吸附能力的影响(25 ℃)Table 2 Influence of flow rate on the adsorption capacity of resin(25 ℃)

2.3.2 树脂柱层析动态洗脱条件优化 丝胶蛋白动态洗脱曲线如图5所示。从图5可以看出,使用pH2、0.05 mol/L氯化钠作为洗脱剂获得的丝胶蛋白洗脱峰相对比较集中,无拖尾出现,最重要的是比pH3、0.1 mol/L氯化钠作为洗脱剂得到的丝胶蛋白含量高。从图5可以看出,采用pH2、0.05 mol/L氯化钠作为洗脱剂时,洗脱液总体积4.0 BV,其中在1.7～3.0 BV段洗脱液中丝胶蛋白的含量较高,丝胶蛋白基本被洗脱下来。收集1.7～3.0 BV段洗脱液,丝胶蛋白的洗脱率达98.76%，丝胶蛋白浓缩倍数达到16.33。孙晓雪等[27]使用DEAE-52离子交换树脂纯化玉米须总多糖,洗脱过程中使用了10 BV水和15 BV的0.1 mol/L的氯化钠溶液才将吸附的中性总多糖和酸性总多糖洗脱下来。与之相比,本实验洗脱剂用量低,达到富集回收废水中丝胶蛋白的目的。

图5 丝胶蛋白的动态洗脱曲线Fig.5 Desorption curves of sericin on DEAE-52 resin column

2.3.3 洗脱速率的确定 分别以不同的洗脱速率(1、2、3 BV/h)对吸附等量丝胶蛋白的树脂进行解析,根据动态洗脱曲线,收集丝胶蛋白含量较高的洗脱液,55 ℃烘箱中干燥至恒重,按照公式计算洗脱物中丝胶蛋白的回收率及纯度,如表3所示。

表3 洗脱流速对丝胶蛋白的回收率及纯度影响(25 ℃)Table 3 Influence of elution rate on the recoveries and purities of sericin(25 ℃)

从表3可以看出,洗脱速率低时,丝胶蛋白回收率高、纯度高,但时间较长。而洗脱速率过快,解析液以较快的速度经过树脂还未来得及与树脂充分接触已流过柱子,导致丝胶蛋白的回收率和纯度有所降低。刘生杰等[28]用DEAE-52离子交换树脂纯化猪血清免疫球蛋白G,洗脱得到两个峰,蛋白纯度分别为95.7%和59%。此外有文献使用无水乙醇法提取废水中的丝胶蛋白,得到的提取物中蛋白质含量约为92%,但无水乙醇易导致蛋白质变性,影响其溶解性[29]。当洗脱流速2.0 BV/h时,用时较短,同时丝胶蛋白的回收率和纯度较高,分别为95.26%和96.71%,优于前人的研究结果。可见DEAE-52离子交换树脂对缫丝废水中丝胶蛋白具有很好的富集回收、纯化效果。

3 结论

由于企业采集废水的难度较大,本文对工业缫丝废水进行了分析,并在此基础上,模拟缫丝工艺制备模拟缫丝废水。选择六种极性大孔树脂和离子交换树脂进行模拟缫丝废水中丝胶蛋白的吸附分离。通过静态吸附和解析性能,筛选出DEAE-52树脂为理想的吸附剂。通过对DEAE-52树脂动态吸附和解析性能的考察,得出对丝胶蛋白分离纯化的最佳工艺条件:上样速度5 BV/h，洗脱剂为pH2,浓度为0.05 mol/L的氯化钠溶液,洗脱速度为2 BV/h,洗脱体积为4 BV。在此工艺下丝胶蛋白的总回收率为95.26%,纯度可达96.71%。采用DEAE-52树脂分离纯化缫丝废水中丝胶蛋白具有广阔的工业前景。

[1]田亚峰,段亚峰,尉霞. 丝绸工业废水中丝胶蛋白质的回收技术[J]. 丝绸,2001(7):23-25.

[2]王维维,朱文静. 丝胶蛋白在组织工程中的应用概况[J]. 中国药业,2012,21(10):14-16.

[3]范金波,王芳,孙雁,等. 丝胶蛋白酶解产物抗氧化活性的研究[J]. 食品科学,2008(5):250-253.

[4]陈复生,叶崇军,魏兆军. 蚕丝天然丝胶蛋白的紫外吸收能力研究[J]. 天然产物研究与开发,2013(3):388-390.

[5]府静燕.丝胶蛋白的回收新方法及其在纺织品中的应用[D]. 上海:东华大学,2007.

[6]Khampieng T,Aramwit P,Supaphol P. Silk sericin loaded alginate nanoparticles:Preparation and anti-inflammatory efficacy[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,80:636-643.

[7]刘兆刚.结构仿生型丝胶蛋白微胶囊的制备及其应用研究[D]. 杭州:浙江理工大学,2014.

[8]Zhang Y,Liu J,Huang L,et al. Design and performance of a sericin-alginate interpenetrating network hydrogel for cell and drug delivery[J]. Scientific Reports,2015,5:12374.

[9]胡桂燕,王永强,李有贵,等. 丝胶蛋白性能及美白防晒乳的研制[J]. 丝绸,2010(4):27-30.

[10]Jo Y N,Um I C. Effects of solvent on the solution properties,structural characteristics and properties of silk sericin[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,78:287-295.

[11]严晨峰,刘琳,姚菊明. 壳聚糖/丝胶蛋白生物流体材料的制备及性能测试[J]. 蚕业科学,2013(3):593-598.

[12]Aramwit P,Yamdech R,Ampawong S. Controlled Release of Chitosan and Sericin from the Microspheres-Embedded Wound Dressing for the Prolonged Anti-microbial and Wound Healing Efficacy[J]. The AAPS Journal,2016,18(3):647-658.

[13]罗富英,吴桂枝,李冰霞,等. 蚕丝胶蛋白可食性包装薄膜的制备[J]. 食品工业科技,2009(4):271-273.

[14]王群,齐鲁. 丝胶蛋白在纤维与纺织品中的应用[J]. 合成纤维,2006(11):28-31.

[15]张慧媛,崔建云,胡长利,等. 蚕丝的理化性质及其在食品中的应用[J]. 食品工业科技,2008(7):309-312.

[16]张凤秀,刘园圆,王敏,等. 食用胆水法提取丝绸废水中丝胶蛋白的研究[J]. 西南大学学报(自然科学版),2013(7):101-105.

[17]李克弯.丝绵脱胶废水中丝胶提取工艺及其应用研究[D]. 苏州:苏州大学,2010.

[18]Wu M,Yue J,Zhang Y. Ultrafiltration recovery of sericin from the alkaline waste of silk floss processing and controlled enzymatic hydrolysis[J]. Journal of Cleaner Production,2014,76:154-160.

[19]曹红翠. 紫外分光光度法测定蛋白质的含量[J]. 广东化工,2007,34(8):93-94.

[20]黄磊,岳鹏翔,郁军,等. 大孔吸附树脂富集酯型儿茶素[J]. 食品科学,2013(6):68-72.

[21]马荣锴,王立升,黎铉海,等. 大孔树脂对菥蓂总黄酮的静态吸附分离特性研究[J]. 食品工业科技,2012(13):96-99.

[22]张文斌,许时婴. 大孔吸附树脂法分离纯化亚麻木酚素的研究[J]. 食品工业科技,2006(10):96-102.

[23]张俊生,朱士龙,李俊,等. 大孔树脂对节节草总黄酮吸附分离特性研究[J]. 食品工业科技,2012(13):236-239.

[24]府静燕,闵洁. 丝胶蛋白质离子交换回收方法的研究[J]. 丝绸,2008(1):26-29.

[25]Lan Q D,Bassi A S，Margaritis A，et al. A modified Langmuir model for the prediction of the effects of ionic strength on the equilibrium characteristics of protein adsorption onto ion exchange/affinity adsorbents[J]. Chemical Engineering Journal,2001,81:179-186.

[26]代菊红.重组类人胶原蛋白I的分离纯化研究[D]. 西安:西北大学,2005.

[27]孙晓雪,康杰,王昶,等. DEAE纤维素纯化玉米须总多糖的工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志,2014(15):28-30.

[28]刘生杰,余为一,朱茂英,等. DEAE-52层析对猪血清IgG提纯得率的影响[J]. 食品科学,2008,29(4):87-89.

[29]吴金鸿,王璋,许时婴. 丝绸废水中丝胶提取方法的研究[J]. 食品与发酵工业,2007,33(6):136-140.

Adsorption separation of sericin from simulation filature wastewater by resin

JIAO Rui-ting,JIANG Hong-rui,WANG Cheng-hua,ZHAO Mou-ming,LIU Xiao-ling*

(College of Light Industry and Food,Guangxi University,Nanning 530004,China)

The sericin adsorption and desorption ability from simulation filature of six types of resins,AB-8,LX-1180,D101,DA201-C,DEAE-52 and 201×7 were compared and the best resin was selected. The optimal sericin separation parameters were determined by static and dynamic absorption experiment. The results showed that sericin adsorption capacity and recoverity of DEAE-52 ion exchange resin were much higher than other resins reached 1.573 mg/g and 95.07%,respectively. During the column separation,filature wastewater flowed with 5 BV/h into column,and then was eluted with 4 BV of pH2,0.05 mol/L sodium chloride solution by 2 BV/h,then 1.7～3.0 BV elution fractions was collected,the desorption ratio was 98.76%. After column separation,the recoverd sericin concentrated 16.33 times of wastewater,and the total recovery rate and purity of collected sericin were 95.26% and 96.71%,respectively.

filature wastewater;sericin;resin;adsorption

2016-11-07

焦瑞婷(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：蛋白质资源的开发利用，E-mail:18275796165@163.com。

*通讯作者:刘小玲(1972-)，女，博士，教授，研究方向：生物大分子结构与性质，E-mail:13877173857@163.com。

广西重大基金项目(2016JJE120003)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)10-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.036