大麦乳酸菌发酵液粉中多酚的提取及其抗氧化性研究

姚 芳,肖 香,董 英,*

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)



大麦乳酸菌发酵液粉中多酚的提取及其抗氧化性研究

姚 芳1,2,肖 香2,董 英2,*

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

通过单因素和正交实验优化大麦乳酸菌发酵液粉(barley lactobacillus fermented solution,BLFS)中多酚的提取工艺条件,高效液相色谱分析鉴定多酚成分,并对其抗氧化活性进行测定。结果表明:在60%的乙醇浓度,1∶50 g/mL的料液比,60 ℃提取60 min的最优条件下,BLFS多酚的提取率为(18.09±0.25) mg/g;HPLC分析结果显示,经乳酸菌发酵后大麦多酚中没食子酸、香豆酸、阿魏酸和芦丁的含量显著增加(p<0.05),香草酸和对香豆酸的含量显著减少(p<0.05),BLFS多酚的主要成分为芦丁35.08 μg/g,香草酸21.28 μg/g,阿魏酸19.38 μg/g,香豆酸11.36 μg/g,没食子酸6.80 μg/g,原儿茶酸2.99 μg/g,对香豆酸0.83 μg/g。BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物清除羟自由基、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和还原能力的半数有效质量浓度(EC50)分别为0.66和0.87、0.88和0.96、0.76和0.89 mg/mL,具有良好的体外抗氧化活性。BLFS多酚提取物的抗氧化活性均高于大麦多酚提取物,说明经乳酸菌发酵后大麦的抗氧化活性增加。

大麦,乳酸菌,抗氧化,多酚,提取,高效液相色谱

大麦是我国传统的药食兼用作物,产量位居世界粮食作物第4位,但我国大麦的主要用途是啤酒酿造和饲料工业,仅有10%左右的大麦用于食用,利用率十分低下[1]。近年来大麦的生理功能受到了关注,研究证实大麦由于富含酚类化学物而具有较强的抗氧化活性[2]。大麦多酚含量较高,总多酚含量可达1200～1500 mg/kg[3],主要包括香草酸、香豆酸、阿魏酸、原儿茶酸和芦丁等[4]。多酚物质有自由和结合两种形式,自由形式主要是黄酮类,结合形式主要是酚酸[5],小分子多酚具有较高的抗氧化性[6]。研究发现大麦中不溶性酚类含量和可溶性酚类含量比值为27∶1～35∶1[7-8],淀粉酶、蛋白酶等水解酶会导致与细胞结构结合的多酚物质释放,大麦抗氧化活性增加[9]。大麦是乳酸菌发酵的良好基质[10],经乳酸菌发酵后大麦中叶酸、γ-氨基丁酸、多肽、可溶性膳食纤维等营养活性成分的含量显著升高[11];大麦中含有的多酚类物质经乳酸菌发酵后,由结合态转化为游离态,从而发酵产物的多酚明显增加,抗氧化活性增加[12-13]。

本实验采用乙醇为提取溶剂,通过正交实验优化大麦乳酸菌发酵液中多酚的最优提取条件,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法分析鉴定多酚成分,并通过体外实验研究其抗氧化活性,为大麦的高效利用和天然抗氧化产品的开发提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜脱壳大麦 购自盐城市双增农化科技有限公司;植物乳杆菌(LactobacillusplantarumDy-1,CGMCC No.6016) 江苏大学食品与生物工程学院实验室分离贮藏;1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)(分析纯)、Trolox(分析纯) Sigma公司;香豆酸、香草酸、阿魏酸、没食子酸、原儿茶素、芦丁、对香豆酸和咖啡酸(标准品,纯度≥98%) FEMIKER公司;乙腈(色谱纯) TEDIA公司;抗坏血酸、福林酚、乙醇等试剂 均为国产分析纯。

高速万能粉碎机 天津市华鑫仪器厂;SPX-250S-Ⅱ生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面垂直净化工作台 吴江市亚泰净化设备有限公司;台式冷冻干燥机 美国LABCONCO公司;PRIMOR高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher;BS-IE振荡培养箱 上海一恒科技有限公司;AUTOCLAVE·G154DWS 高压蒸汽灭菌锅 上海申胜生物技术有限公司;AL204分析天平 梅特勒-托利多有限公司;DF-101Z恒温加热磁力搅拌器 郑州予华仪器制造有限公司;T6分光光度计 北京普析通用有限公司;RE52-03旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DHG-9101-2型电热恒温鼓风干燥箱 上海市实验仪器总厂;LC-20A型HPLC色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大麦乳酸菌发酵液粉的制备 将新鲜的大麦脱壳磨粉过100目筛,按料液比1∶7 g/mL溶于水中混合均匀,添加2%的乳酸菌冻干粉,搅拌均匀,30 ℃发酵24 h,8000 r/min离心20 min,收集上清液,冷冻干燥后,即为大麦乳酸菌发酵液粉(barley lactobacillus fermented solution,BLFS)。

1.2.2 BLFS多酚的提取 准确称取2 g左右的BLFS,加入某料液比,某浓度的乙醇回流浸提2次,4 ℃条件下8000 r/min离心20 min,取上清液真空浓缩,所得浓缩液冷冻干燥,得BLFS多酚提取物。

1.2.3 多酚含量与提取率的测定 采用福林酚法进行测定[14]。吸取1 mL BLFS多酚提取液(适当稀释),加5 mL双蒸水和1 mL 福林酚试剂,充分混匀,再加入2 mL的15%的Na2CO3溶液,定容到10 mL,混匀。45 ℃水浴1.5 h后,在760 nm波长下测定吸光度A。以没食子酸为标样,制得标准曲线方程为:

y=11.396x+0.0028(R2=0.9999)。

多酚提取率(mg/g)

1.2.4 BLFS多酚提取工艺优化

1.2.4.1 单因素实验方案 设定70%的乙醇浓度,1∶45 g/mL的料液比,60 ℃提取60 min为固定条件,以多酚提取率为指标,分别考察乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)、提取温度(40、50、60、70、80 ℃)、提取时间(40、60、80、100、120 min)和料液比(1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60 g/mL)对BLFS多酚提取率的影响。

1.2.4.2 正交实验方案 根据单因素实验结果,对BLFS中多酚的提取进行L9(34)正交实验设计,选取乙醇浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、料液比(D)为影响因素,以多酚提取率为指标,对结果进行分析并确定最佳提取条件。因素水平见表1。

表1 BLFS多酚提取正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal array design for BLFS polyphenol extraction

1.2.5 HPLC分析 参考Hole[15]的方法进行样品预处理:分别称取0.5 g多酚提取物溶于10 mL水,用6 mol/L的盐酸溶液将pH调至1.3～1.5,20 mL乙酸乙酯萃取4次,合并萃取液于40 ℃旋转蒸发,残渣溶于2 mL甲醇/水(25∶75,v/v)溶液,0.45 μm滤膜过滤后上样。

参照Kubola[16]的方法进行HPLC测定:菲罗门反相C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:室温;检测器:UV-DAD(紫外-二极管阵列检测器);检测波长:278 nm;进样量:20 μL;流速:0.8 mL/min;流动相A:1%乙酸水溶液;流动相B:1%乙酸,25%乙腈及74%水的混合溶液;梯度洗脱程序:0 min,5% B;40 min,70% B;45 min,80% B;55 min,85% B;57 min,90% B;75 min,90% B。

1.2.6 抗氧化能力测定 以还原能力、体内清除羟自由基和DPPH自由基能力作为衡量多酚提取物抗氧化能力的指标。将按最优工艺提取出的BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物配制成质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多酚测定液,并分别配制相同质量浓度的VC和Trolox作为阳性对照,参照Vaquero[17]的方法测定还原能力,参照Li[18]的方法测定羟自由基清除率,参照王希[19]的方法测定DPPH自由基清除率。

1.3 数据统计分析及半数有效浓度EC50的计算

参照于童[20]的方法用GraphPad Prism 5.0来计算EC50,应用SPSS 18和Excel 2007进行数据处理和分析,每个数据重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 BLFS多酚提取的单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对BLFS多酚提取率的影响 研究不同乙醇浓度对BLFS多酚提取率的影响,结果如图1所示。

图1 乙醇浓度对BLFS多酚提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of BLFS polyphenol注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05);图2～图4同。

由图1可知,不同浓度的乙醇对BLFS多酚的提取率有显著性影响,随乙醇浓度的升高,BLFS多酚的提取率呈先增加又降低的趋势,乙醇浓度在70%时,BLFS多酚的提取率达到最大值,这可能是70%乙醇的极性与BLFS多酚类物质的极性最相近,此时多酚类物质的溶解度最高,与刘清[21]的研究结果相似。故选择60%、70%和80%乙醇浓度做后续正交实验。

2.1.2 提取温度对BLFS多酚提取率的影响 研究不同提取温度对BLFS多酚提取率的影响,结果如图2所示。

图2 提取温度对BLFS多酚提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of BLFS polyphenol

由图2可知,不同提取温度对BLFS多酚的提取率有较大影响,随提取温度的升高,BLFS多酚的提取率呈先增加又降低的趋势,70 ℃时BLFS多酚的提取率最高,这可能是温度提高有利于多酚类物质的扩散和提取,但温度过高,多酚类物质易发生降解或氧化反应[22]。故选择60、70和80 ℃的提取温度做后续正交实验。

2.1.3 提取时间对BLFS多酚提取率的影响 研究不同提取时间对BLFS多酚提取率的影响,结果如图3所示。

由图3可知,不同提取时间对BLFS多酚提取率的影响较小,可能是因为BLFS是发酵液的冻干粉,溶解度好。随提取时间的延长,BLFS多酚的提取率呈先增加又缓慢降低的趋势,提取时间在80 min时,BLFS多酚的提取率最高,60～80 min时,提取率增幅缓慢但无显著性差异,多酚的溶出达到平衡,超过100 min,提取率下降。这可能是在提取时间过短,与蛋白质结合的多酚类物质未充分溶出,提取时间过长,部分热敏性组分由于高温长时受热而被破坏,从而使多酚类物质提取率下降[22]。综合经济因素,选择40、60和80 min的提取时间做后续正交实验。

图3 提取时间对BLFS多酚提取率的影响Fig.3 Effect of time on extraction rate of BLFS polyphenol

2.1.4 料液比对BLFS多酚提取率的影响 研究不同料液比对BLFS多酚提取率的影响,结果如图4所示。

图4 料液比对BLFS多酚提取率的影响Fig.4 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction rate of BLFS polyphenol

由图4可知,不同料液比对BLFS多酚的提取率有一定影响,随料液比的增加,BLFS多酚的提取率呈先增加又降低的趋势,料液比在1∶50 g/mL时,BLFS多酚的提取率最高。料液比1∶60 g/mL时,提取率略微下降,这可能是在一定料液比范围内,增加溶剂量能提高样品颗粒与溶剂的接触面积,促进多酚类物质的溶出;但溶剂用量过高,对BLFS内的某些物质促进溶出作用会比对多酚显著,改变了细胞内外渗透压,不利于多酚的溶出[23],与刘清[22]的研究结果一致。故选择1∶45、1∶50和1∶55 g/mL的料液比做后续正交实验。

2.2 BLFS多酚提取的正交实验

根据单因素实验结果,以多酚提取率为考察指标,进行正交实验,实验结果见表2,方差分析见表3。通过分析得到最优组合,确定BLFS多酚的最优提取工艺条件。

表2 BLFS多酚提取工艺优化正交实验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and experimental results for BLFS polyphenol extraction

表3 正交实验方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design

注:*.差异显著(p<0.05)。

由表2、表3可知,影响BLFS多酚提取效果因素的主次顺序为A>B>D>C,即乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间。由k值可以确定BLFS多酚的最优提取工艺组合为A1B1C2D2,即60%的乙醇浓度,1∶50 g/mL的料液比,60 ℃提取60 min,多酚提取率(18.09±0.25) mg/g是最高。由方差分析可知,实验的误差小且误差自由度高,说明检验的灵敏度高,各因素在p<0.05的水平上都有显著性差异。

2.3 提取物的得率和多酚含量

按照最佳多酚提取工艺制得BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物,分别测定其得率和多酚提取率见表4。

表4 BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物的得率及多酚提取率Table 4 Yield and extraction rate of BLFS polyphenol and barley polyphenol

注:同列小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。

由表4可知,从24 h和0 h大麦发酵物中提取多酚得到BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物的得率分别为36.38%±3.25%和27.52%±3.84%,二者有显著差异。BLFS多酚提取物的得率显著高于大麦多酚提取物的得率,大麦在发酵过程中,在乳酸菌的作用下,结合多酚得以释放[13],同时有机酸、氨基酸、小分子肽等可溶性极性物质的含量增加。BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物的多酚提取率分别为(18.09±0.25) mg/g和(17.73±0.27) mg/g,两者无显著差异。可能是因为经乙醇高温长时间提取后,发酵在增加可溶性多酚物质含量上的作用不明显,发酵的作用主要体现在改变多酚物质的结构和种类,使结合态多酚化合物变为游离态多酚化合物,提高其生物活性。

2.4 BLFS多酚和大麦多酚成分的HPLC分析鉴定

大麦多酚和BLFS多酚的HPLC色谱图如图5(B)和图5(C)所示,通过与图5(A)各标准品的色谱峰保留时间相对比,分析鉴定BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物中多酚的成分并对比分析差异性如图6所示。由图6可知,经乳酸菌发酵后大麦多酚的种类和各自的含量发生了显著变化,其中没食子酸、香豆酸、阿魏酸和芦丁的含量显著增加(p<0.05),香草酸和对香豆酸的含量显著减少(p<0.05),原儿茶酸含量基本不变。BLFS多酚提取物中含量最多是芦丁为35.08 μg/g,其次是香草酸21.28 μg/g,阿魏酸19.38 μg/g,香豆酸11.36 μg/g,没食子酸6.80 μg/g,原儿茶酸2.99 μg/g,对香豆酸0.83 μg/g。研究表明,乳酸菌发酵能提高大麦游离态多酚化合物中阿魏酸、香豆酸的含量[10],其原因是植物乳杆菌生长过程中产生阿魏酸酯酶和香豆酸酯酶协同木聚糖酶水解多酚链接植物细胞壁多糖上的羧酸酯键,将阿魏酸和其他多酚化合物释放出来,即由结合态多酚化合物变为游离态多酚化合物[24]。

图5 HPLC图谱Fig.5 HPLC chromatogram注:A.混合标准品溶液的HPLC图谱;B.大麦多酚的 HPLC图谱;C. BLFS多酚的HPLC图谱。

图6 大麦多酚和BLFS多酚物质的HPLC分析测定结果Fig.6 HPLC analysis results of BLFS polyphenol and barley polyphenol

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 多酚提取物的还原能力 还原力越强,抗氧化活性越好,不同质量浓度样液的还原能力测定见图7。

图7 BLFS、大麦多酚提取物和VC、Trolox的还原力Fig.7 Reducing capacity of polyphenols extraction from BLFS and barley,VC and Trolox

由图7可知,在实验浓度范围内(0～1 mg/mL),各样品对羟自由基均具有一定的清除能力,呈现一定的量效关系。同等浓度条件下,各样品还原能力大小顺序基本为:VC>Trolox>BLFS多酚提取物>大麦多酚提取物。VC的还原力最强,加样浓度为0.2 mg/mL时,OD值超过0.5。加样浓度>0.8 mg/mL时,BLFS多酚提取物的还原力显著高于大麦多酚提取物(p<0.05),说明在大麦乳酸菌发酵的过程中,有一定量的还原性物质生成[25]。BLFS多酚提取物、大麦多酚提取物、VC、Trolox的EC50值分别为0.76、0.89、0.22、0.41 mg/mL。加样浓度1.0 mg/mL时,BLFS多酚提取物的OD值达0.565,表现出较强的还原能力。

2.5.2 多酚提取物对羟自由基的清除能力 羟自由基是氧化能力极强的自由基,通过测定其的清除率来判断样品的抗氧化能力,清除率越高,抗氧化能力越强。不同质量浓度的样液对羟自由基的清除能力见图8。

图8 BLFS、大麦多酚提取物和VC、Trolox清除羟自由基的能力Fig.8 Scavenging effects of polyphenols extraction from BLFS and barley,VC and Trolox on hydroxyl radical

由图8可知,各样品对羟自由基均具有一定的清除能力,呈现一定的量效关系。在同等浓度条件下,各样品对羟自由基清除能力的大小顺序基本为:VC>Trolox>BLFS多酚提取物>大麦多酚提取物。VC对羟自由基的清除能力最强,加样浓度为0.2 mg/mL时,清除率超过了50%。加样浓度>0.4 mg/mL时,BLFS多酚提取物对羟自由基的清除能力显著高于大麦多酚提取物(p<0.05),说明在乳酸菌的作用下,大麦中一些多酚由结合态转化为游离态,其种类和含量都发生了变化,从而抗氧化活性增加[13]。BLFS多酚提取物、大麦多酚提取物、VC、Trolox的EC50值分别为0.66、0.87、0.17、0.37 mg/mL。加样浓度>0.8 mg/mL时,BLFS多酚提取物对羟自由基的清除率>50%,与Trolox的清除率没有显著差异,表现出较强的抗氧化能力。

2.5.3 多酚提取物对DPPH自由基的清除能力 待测样品清除DPPH自由基能力可评价其阻断脂质过氧化链反应的水平[26],样品对DPPH自由基的清除率越高,其抗氧化能力越强。不同质量浓度的样液对DPPH自由基的清除能力见图9。

图9 BLFS、大麦多酚提取物和VC、Trolox清除DPPH自由基的能力Fig.9 Scavenging effects of polyphenols extraction from BLFS and barley,VC and Trolox on DPPH radical

由图9可知,各样品对DPPH自由基均具有一定的清除能力,呈现一定的量效关系。在同等浓度条件下,各样品对DPPH自由基清除能力的大小顺序基本为:VC>BLFS多酚提取物>Trolox>大麦多酚提取物。加样浓度>0.6 mg/mL时,BLFS多酚提取物对DPPH自由基的清除能力显著高于大麦多酚提取物(p<0.05),说明在乳酸菌的作用下,BLFS中的多酚有更强的供氢能力[27]。BLFS多酚提取物、大麦多酚提取物、VC、Trolox的EC50值分别为0.88、0.96、0.22、0.88 mg/mL。加样浓度>0.8 mg/mL时,BLFS多酚提取物对DPPH自由基的清除率优于Trolox的清除率,表现出较强的抗氧化能力。

3 结论

通过单因素和正交实验优化BLFS多酚的提取工艺条件为60%的乙醇浓度,1∶50 g/mL的料液比,60 ℃提取60 min,BLFS多酚的提取率为(18.09±0.25) mg/g;影响BLFS多酚提取效果因素的主次顺序为:乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间。HPLC色谱分析可知,经乳酸菌发酵后大麦中没食子酸、香豆酸、阿魏酸和芦丁的含量显著增加(p<0.05),香草酸和对香豆酸的含量显著减少(p<0.05)。BLFS多酚的主要成分为芦丁35.08 μg/g,香草酸21.28 μg/g,阿魏酸19.38 μg/g,香豆酸11.36 μg/g,没食子酸6.80 μg/g,原儿茶酸2.99 μg/g,对香豆酸0.83 μg/g。BLFS多酚提取物和大麦多酚提取物清除羟自由基、DPPH自由基和还原能力的EC50值分别为0.66和0.87、0.88和0.96、0.76和0.89 mg/mL,具有良好的体外抗氧化活性。BLFS多酚提取物的抗氧化活性高于大麦多酚提取物,说明经乳酸菌发酵后大麦的抗氧化活性增加,为大麦的高效利用和天然抗氧化产品的开发提供新的途径。

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Extraction and antioxidant activity of polyphenols from barley lactobacillus fermented solution

YAO Fang1,2,XIAO Xiang2,DONG Ying2,*

(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China;2.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Single factor experiment and an orthogonal array design were used in combination to optimize the extraction conditions of polyphenols from barley Lactobacillus fermented solution(BLFS). High performance liquid chromatography(HPLC)was employed to identify the chemical composition of polyphenols. Antioxidant activities of the extracted polyphenols were also measured in this study. The results showed that under the optimum conditions:ethanol concentration 60%,solid-to-liquid ratio 1∶50 g/mL,extraction temperature 60 ℃,and extraction time 60 min,the extraction yield of BLFS polyphenols was(18.09±0.25) mg/g. The results of chromatograph analysis with HPLC showed significant increase of gallic acid,coumaric acid,ferulic acid and rutin contents in barley after lactobacillus fermentation(p<0.05). On the contray,vanillic acid and p-coumaric acid contents reduced dramatically(p<0.05). In BLFS polyphenols,main components including rutin,vanillic acid,ferulic acid,coumaric acid,gallic acid,protocatechuic acid and p-coumaric acid,their contents were 35.08,21.28,19.38,11.36,6.80,2.99 μg/g and 0.83 μg/g respectively. The polyphenols extraction from BLFS and barley displayed excellent antioxidant activities with half maximal effective concentration(EC50)values of 0.66 and 0.87,0.88 and 0.96,0.76 and 0.89 mg/mL for scavenging hydroxyl,DPPH radicals and reducing capacity,respectively. Antioxidant activities of BLFS polyphenols extraction were higher than these of barley polyphenols extraction,showed that barley increased antioxidant activity by Lactobacillus Fermentation.

barley;lactobacillus;antioxidant activity;polyphenols;extraction;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-11-04

姚芳(1980-)，女，博士研究生，副教授，研究方向：食品功能成分提取及生物活性， E-mail：yaofang7577@163.com。

*通讯作者:董英(1954-)，女，大学本科，教授，研究方向：食品营养与安全，E-mail：ydong@ujs.edu.cn。

江苏省2013年度普通高校研究生科研创新计划项目(CXZZ13_0694)；学院科研课题(NSFYB1304)。

TS210.1

A

1002-0306(2017)10-0211-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.032