β-环糊精提高乳酸菌发酵大麦粉提取物的抗氧化及结构稳定性研究

李明松,董 英,张家艳,赵延胜

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)



β-环糊精提高乳酸菌发酵大麦粉提取物的抗氧化及结构稳定性研究

李明松,董 英*,张家艳,赵延胜

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

本文研究β-环糊精(β-cyclodextrin,BC)对植物乳杆菌发酵大麦粉提取物(fermented barley extract ofLactobacillusplantarum,LFBE)的抗氧化及结构稳定性的增强作用,以期制备具有预期生物活性的较稳定LFBE。采用冷冻干燥法制备BC与LFBE包埋物(fermented barley extract ofLactobacillusplantarumembedding with BC,BLFBE)冻干粉,借助扫描电镜和X-射线衍射技术研究其微观结构。抗氧化活性实验结果表明,LFBE在常温贮藏12 h后,其多酚化合物含量由(0.30±0.11) mg/mL迅速降至(0.019±0.0023) mg/mL,其DPPH自由基清除率由67.95%±2.16%降至9.16%±0.65%,·OH自由基清除率由72.97%±3.01%下降至11.14%±3.16%;采用1.6%的BC对LFBE进行包埋处理后,BLFBE内多酚化合物含量由(0.25±0.015) mg/mL仅降至(0.21±0.01) mg/mL,其DPPH自由基清除率由52%±2.01%则仅降至45%±2.43%,·OH自由基清除率由67.16%±1.31%仅降至54.74%±2.53%。LFBE色度检测结果表明,BC包埋作用能显著抑制LFBE的L*值在常温24 h内的快速下降,使其在冷冻干燥前保持稳定色泽。扫描电镜图显示,LFBE冻干粉为不规则片状结构,而经BC包埋后变为易分散的类球状结构;X-射线衍射结果发现LFBE冻干粉为非晶型、不定型结构,经BC包埋的BLFBE冻干粉出现晶体结构。因此,采用BC直接包埋LFBE,可有效抑制LFBE抗氧化活性下降与褐变,并增加BLFBE冻干粉的结构稳定性。

β-环糊精,植物乳杆菌,大麦粉,多酚化合物,抗氧化活性,结构,稳定性

大麦属于乔本科,一年生草本植物,是世界最古老的谷物类作物之一,种植面积仅次于小麦、玉米和水稻,主要用于啤酒工业原料、饲料、医药和食品行业。研究表明,大麦含有丰富蛋白质、膳食纤维、维生素以及多酚,还含有大麦黄酮、大麦芽酚、大麦芽碱、大麦角类尿囊素等微量活性成分,因此大麦也被称为谷物中的全价食品[1]。植物乳杆菌是一种益生菌,其生长温度在30～37 ℃,厌氧或兼性厌氧,常见于奶油、谷物以及蔬菜发酵制品中,是优秀的营养改良者[2-4]。

ZHANG J等[5]已有研究发现大麦粉经植物乳杆菌发酵后,LFBE内游离多酚含量增加近10倍。后续深入研究发现,植物乳杆菌发酵大麦粉提取物内(fermented barley extract ofLactobacillusplantarum,LFBE)多酚化合物能有效抑制3T3-L1的脂肪合成,并显著下调与肥胖相关基因表达水平。因此,初步判断LFBE中多酚化合物是抑制脂肪在脂肪细胞中合成的主要活性成分之一[6]。但是,LFBE内多酚化合物易氧化且使其呈不易分散的絮状结构,从而影响LFBE作为食品原料或辅料的应用。因此,如何保持LFBE抗氧化活力并改善LFBE结构形态的问题值得研究。

近些年来,环糊精已经被广泛用于包埋药物,以提高药物溶解性与稳定性[7]。基于环糊精优异的包埋作用,有研究已经尝试使用环糊精包埋多酚化合物,以增加其稳定性、生物活性以及生物可利用度[8]。环糊精中β-环糊精(β-cyclodextrin,BC)常被用于包埋多酚化合物,众多研究表明这种方法可显著提高咖啡酸、儿茶酚、绿原酸、香豆酸、阿魏酸等酚酸类物质在水溶液中的稳定性、抗氧化性和溶解性[9-12]。而利用BC保护大麦发酵提取物,以提高其多酚化合物稳定性的研究尚少见报道。本文采用BC直接包埋LFBE,研究其对LFBE抗氧化活性及其色泽的保护作用,并通过冷冻干燥制备微胶囊,借助扫描电镜和X-射线衍射分析BC与LFBE包埋物(fermented barley extract ofLactobacillusplantarumembedding with BC,BLFBE)的特性,为植物乳杆菌发酵大麦提取物的制备及其应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大麦:扬饲麦3号 盐城市双增农业科技有限公司;菌种:植物乳杆菌(Lactobacillusplantatumdy-1,L.Pdy-1) 由江苏大学应用生物技术实验室分离,保藏于中国菌种保藏中心(CGMCC NO.6016);BC、福利酚试剂、酵母浸膏、牛肉浸膏、胰蛋白胨、FeSO4、H2O2、水杨酸 均购自国药集团化学试剂有限公司;考马斯亮蓝G250 购自北京鼎国昌生物技术有限公司;DPPH 购自成都麦卡希化工有限公司。

Sartorius万分之一电子天平 北京赛多斯依稀系统有限公司;7200型分光光度计、PHS-3TC型酸度计 上海天达仪器有限公司;Card分光测色仪 美国HunterLab公司;多晶X射线衍射仪 德国Bruker公司;S-3400N扫描电子显微镜 日本Hittachi公司;高速万能粉碎机 浙江屹立工贸有限公司;8411型电子振筛机 上虞市道墟越州土工仪器厂;3110-P1000型移液枪 德国Eppendorf;YX400Z高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;BR-4冷冻离心机 法国JOUAN公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;生化培养箱 宁波国华仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 麦粉的制备 利用高速万能粉碎机将大麦粒粉碎,过80目筛后,保存于20 ℃。

1.2.2 直投菌液的制备 取保存于20 ℃内的菌种,用MRS培养基于31 ℃连续活化两次,每次活化12 h,使菌体密度达到4 cfu/mL后,5000 r/min离心15 min,弃去上清,用等体积无菌去离子水重新悬浮菌体。

1.2.3 LFBE和BLFBE的制备 将大麦粉和水以1∶7的比例加进锥形瓶,直接投入8×107cfu/g的菌体,漩涡振荡使其充分混合后,将锥形瓶置于生化培养箱内,34 ℃发酵28 h。发酵结束后以8000 r/min离心15 min,其上清为LFBE。为研究BC添加量对LFBE抗氧化活性的保护作用及褐变的抑制效果,并考虑BC的添加会稀释LFBE固形物含量,因此在LFBE内分别加入4、10与16 mg/mL BC。通过单因素优化BC包埋条件,较优工艺为40 ℃、200 r/min搅拌水浴10 min使BC充分溶解,作为BLFBE。最后,采用冷冻干燥法,制备LFBE与BLFBE各自的冻干粉。

1.2.4 多酚化合物含量测定 LFBE与BLFBE在常温下贮藏12 h,每隔3 h取样并测定样品内多酚含量。采用福林酚法测试样品内多酚化合物含量[13],标曲为:y=0.0107x+0.0178,R2=0.9963。

1.2.5 DPPH自由基清除率测定 LFBE与BLFBE在常温下贮藏12 h,每隔3 h取样并测定样品的DPPH自由基清除率。采用Danyue Zhao等测定茶多酚DPPH自由基清除率的测试方法[14],即将0.2 mL样品液加入3.8 mL 0.039 g/L DPPH后放置于暗处30 min,然后在515 nm处测定样品吸光值,且用0.2 mL甲醇替换样品作为对照组。DPPH自由基清除率计算公式为:

DPPH自由基清除率(%)=(A0-As)/A0×100

式中:A0：未加样品的吸光值;As：加样品的吸光值。

1.2.6 ·OH自由基清除率测定 LFBE与BLFBE在常温下贮藏12 h,每隔3 h取样并测定样品的羟自由基清除率。采用Shen等对黑大麦多酚的·OH清除率测定方法[15],即将1.0 mL样品加入含有1.0 mL 9 mmol/L水杨酸、1.0 mL 9 mmol/L FeSO4和1 mL 8.8 mmol/L H202的反应液,混合均匀,用铝箔包裹并于37 ℃保持60 min,随后在510 nm处测吸光值。·OH自由基清除率计算公式为:

·OH自由基清除率(%)=100[1-(As-A1)/A0]×100

式中:A0：用水代替样品的对照组吸光值;A1：用水代替H2O2的吸光值;As：样品吸光值。

1.2.7 色度测定 LFBE与BLFBE在常温下贮藏24 h,并每隔一段时间对样品进行色度测定。L*值表示亮度,其范围在0(黑)～100(白),其值越小,褐变越严重;a*值表示绿色值/红色值,其值越大表示绿色损失越严重;b*值表示蓝色/黄色值,其值越大颜色越黄。

1.2.8 包埋物特性研究 由BC不同添加量对LFBE内多酚化合物含量、DPPH自由基清除率及其色度的保护效果,并结合国标与实际情况,选取合适的BC添加量,再经冷冻干燥制备LFBE与BLFBE各自的冻干粉。采用扫描电镜和X-射线衍射分析两者微观结构特性。

1.2.8.1 扫描电镜分析 将BC、LFBE冻干粉、BC与BLFBE冻干粉的物理混合粉(Physical mixing powder of BC and LFBE,BMLFBE)以及BLFBE冻干粉研磨均匀,分别固定在样品台上,真空抽干、镀金后,在扫描电镜中观察。

1.2.8.2 X-射线衍射分析 将BC、LFBE冻干粉、BMLFBE以及BLFBE冻干粉进行X-射线粉末衍射分析,分析条件为:Cu/Kα辐射波长0.1540 nm,电压45 kV,电流40 mA,2θ扫描范围5～40°,步长0.02°/min,扫描速度4°/min。

1.2.9 数据处理 每个实验重复三次,取平均值作为最终结果。采用SPSS软件,ANOVA法评估数据的差异显著性,差异性水平设定p<0.05。

2 结果与讨论

2.1 BC保护LFBE抗氧化活性

由图1可以看出,LFBE在0 h的多酚化合物含量最高,而BLFBE在0 h的多酚化合物含量低于LFBE。同时,随着BC添加量增加,BLFBE在0 h的多酚化合物含量逐渐降低,可能因为其部分分子在范德华力、氢键作用、疏水作用的驱动下进入BC疏水空腔内[16],使得其内能检出多酚化合物含量低于LFBE。

随着贮藏时间增加,LFBE内多酚化合物含量一直下降,其多酚化合物含量在12 h内由(0.30±0.11) mg/mL减少至(0.019±0.0023) mg/mL,超过93%的多酚化合物损失。添加BC则能明显抑制BLFBE在12 h内多酚化合物的损失,4、10、16 mg/mL的BC分别对应80%、32%、12%的多酚化合物损失率,说明BC的添加量与多酚的保护效果呈正相关。Ratnasooriya等研究发现BC的包埋作用能有效提取出葡萄内多酚化合物[17],同时有研究使用BC抑制果汁褐变[18],其研究结论与BC抑制LFBE内多酚化合物氧化的结果一致。

图1 多酚含量随贮藏时间的变化Fig.1 The change of polyphenol content along with storage time注:不同字母代表显著性差异(p<0.05);图2、图3同。

由图2可以看出,LFBE在0 h的DPPH自由基清除率最高,由于BC的包合作用,使得BLFBE在0 h的DPPH自由基清除率低于LFBE。同时,随着BC添加量增加,BLFBE在0 h的DPPH自由基清除率逐渐降低,说明LFBE内部分抗氧化成分被BC包埋。随着贮藏时间增加,LFBE的DPPH自由基清除率一直下降,并在12 h内由67.95%±2.16%下降至9.16%±1.65%,其DPPH自由基的清除能力损失约86%。BC的包埋作用则能明显抑制BLFBE在12 h内对DPPH自由基清除率的迅速降低,添加4、10、16 mg/mL的BC,12 h后BLFBE分别保留了约40%、74%、87%的DPPH自由基清除能力,说明BC的添加量与其对DPPH自由基清除率的保护效果呈正相关。

图2 DPPH自由基清除率随贮藏时间的变化Fig.2 The change of DPPH clearance along with storage time

图3 ·OH自由基清除率随时间变化图Fig.3 The change of ·OH clearance along with storage time

由图3可以看出,LFBE与添加不同量BC的BLFBE在0 h对·OH自由基清除能力没有明显差异。随着贮藏时间的增加,LFBE的·OH自由基清除率一直下降,在12 h内由72.97%±3.01%下降至11.14%±3.16%,其·OH自由基清除率能力损失约84%。BC的包埋作用亦能显著保护BLFBE在12 h内对·OH自由基清除能力,添加4、10、16 mg/mL的BC后,12 h后BLFBE分别保留了约45%、64%、81%的DPPH自由基清除能力,说明BC的添加量与其对·OH自由基清除率的保护效果呈正相关。此结果与Thammarat Aree等研究BC抑制绿茶抗氧化能力下降的结果相符[19]。因此,采用BC包埋LFBE的方式作为抑制LFBE多酚化合物氧化,保持其抗氧化活性的方法是可行的。

2.2 BC抑制LFBE褐变

植物乳杆菌发酵大麦粉过程中,其产生的胞外酯酶水解结合态多酚与多糖间的酯键,使结合态多酚变成游离态多酚。同时,发酵过程中产生的低pH环境也会使结合态多酚从大分子多糖上脱落,因此LFBE内多酚化合物含量显著增加。当LFBE内未添加保护剂时,其多酚化合物易被氧化而失去其原有活性,还会引起LFBE褐变[20-21]。采用色度仪分析LFBE与BLFBE在24 h内的色度变化,研究BC包埋作用抑制LFBE褐变的效果。实验结果如图4所示,LFBE在0 h的L*值相对BLFBE的较小,且随着贮藏时间增加,其L*值逐渐降低,说明其褐变程度逐渐加深。随着BC添加量增加,BLFBE在0 h的L*值没有明显差异,但在24 h内的L*值越稳定,说明BC能有效抑制LFBE褐变,且BC添加量与褐变抑制效果呈正相关。同时,从图5、图6可以看出,随着BC添加量的增加,BLFBE的a*与b*值也愈加稳定。从L*、a*、b*值随时间的变化趋势,说明BC能显著抑制LFBE褐变,且使LFBE色度在一段时间内保持稳定性。此结果与Aguilera Yolanda等采用BC包埋花青素以保持饮料色度稳定的结果一致[22]。

图4 L*值随贮藏时间的变化。Fig.4 The change of L* along with storage time注：不同字母代表显著性差异(p<0.05)，图5、图6同。

图5 a*值随贮藏时间的变化Fig.5 The change of a* along with storage time

图6 b*值随贮藏时间的变化Fig.6 The change of b* along with storage time

2.3 BC改变LFBE的微观结构

利用扫描电子显微镜对样品进行微观结构观察,BC、LFBE冻干粉、BMLFBE及BLFBE冻干粉的扫描电镜图如图7所示。从扫描电镜图可以看出,BC为不规则片状晶体;LFBE冻干粉为不规则、凹凸不平的片状结构;BMLFBE为不规则片状结构与片状晶体的混合体;BLFBE冻干粉中出现类球型结构,此结构与于迟研究的环糊精包埋物相似[23],说明BC成功包埋了LFBE中小分子化合物。同时,LFBE冻干粉的不易分散絮状结构在BC的包埋作用下转变为易分散的粉状结构,说明BC的包埋作用也增加了LFBE冻干粉的分散性。

图7 扫描电镜图(800×)Fig.7 The picture of scanning electron microscope(800×)

2.4 BLFBE出现晶体结构

图8 X-射线衍射分析结果Fig.8 The result of X-ray diffraction analysis

X-射线衍射技术是研究晶体中分子三维结构几何性质的一种技术,其衍射线在空间的分布规律是由晶胞大小、形状和位相决定的,而其衍射束的强度则取决于原子种类和原子在晶胞内的位置。分析结果如图8所示。BC的X-射线衍射图是典型的晶体物质谱图,其在角分别为6.2°、8.9°、10.5°、12.4°、12.6°、14.8°、15.3°、16°、17.1°、17.9°、18.9°、19.3°、20.9°、22.9°、24.3°、25.6°、27°处有特征衍射峰;而LFBE冻干粉的X-射线衍射图谱为一个较钝的角,表明LFBE冻干粉是非结晶性、无定型结构;BMLFBE在角分别为12.6°、14.9°、17.1°、17.8°、18.9°、19.5°处有特征衍射峰,但这些特征衍射峰与BC的部分特征衍射峰是相同的,说明此特征衍射峰是掺杂在LFBE冻干粉内BC晶体的特征峰;BLFBE冻干粉在角分别为11.6°、12.6°、14.8°、17.1°、19.3°、20.9°、22.9°处有特征衍射峰,其11.6°、17.1°处特征衍射峰与BC、BMLFEB的特征衍射峰都不同,说明BC包埋LFBE不是简单的混合,而是有晶体形成。因此,相比LFBE冻干粉的无定型结构,BC的包埋作用使BLFBE冻干粉出现晶体结构,而显著提高BLFBE冻干粉结构稳定性。

3 结论

BC的包埋作用能有效保护LFBE的抗氧化活性,提高其对DPPH和·OH自由基清除能力的稳定性,并防止LFBE发生褐变。其作用原理是BC的包埋作用将LFBE中的易氧化类化合物包埋入BC微囊中,将LFBE冻干粉原有不易分散的絮状结构转变为易分散的类球状颗粒结构,同时生成部分晶体结构,从而提高了BLFB的结构稳定性。因此,采用BC直接包埋LFBE不仅可保护LFBE的抗氧化活性,提高其结构稳定性,也有助于扩大LFBE的应用范围。

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The improvement of antioxidant and structural stability of fermented barley extract withLactobacillusplantarumwithβ-cyclodextrin

LI Ming-song,DONG Ying*,ZHANG Jia-yan,ZHAO Yan-sheng

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

β-cyclodextrin(BC)was used to improve the antioxidantand microstructure stability of fermented barley extract withLactobacillusplantarum(LFBE)in order to keep bioactivity of LFBE. LFBE was embedded with BC(BLFBE)and dried with freed-dried method.X-ray diffraction and scanning electron microscope technologies were used to analyze microstructure of BLFBE. The results of antioxidant experiments showed that polyphenol content in LFBE decreased from(0.30±0.11) mg/mL to(0.019±0.0023) mg/mL,its DPPH clearance reduced from 67.95%±2.16% to 9.16%±0.65%,and its ·OH clearance decreased from 72.97%±3.01% to 11.14%±3.16% after storing 12 h at normal temperature. After LFBE embedded with 1.6 mg/mL BC,polyphenol content of BLFBE merely decreased from(0.25±0.015) mg/mL to(0.21±0.01) mg/mL,its DPPH clearance only reduced from 52%±2.01% to 45%±2.43%,and its ·OH clearance only decreased from 67.16%±1.31% to 54.74%±2.53%. The results of chroma experiments indicated that BC inhibited the browning of LFBE. The results of scanning electron microscope showed that LFBE was irregular sheet structure,but appeared near-spherical structure after embedded with BC. X-ray diffraction experiment indicated that LFBE powder was armorphous and shapeless structure,but BLFBE appeared crystal structure after embedded with BC. Therefore,BC significantly inhibited the descent on antioxidant activity of LFBE,and embedding function of BC also improved structural stability of BLFBE.

β-cyclodextrin;Lactobacillusplantarum;barley;polyphenol;antioxidant activity;microstructure;stability

2016-11-04

李明松(1990-)，男，硕士，研究方向：食品营养,E-mail:a1057194600@163.com。

*通讯作者:董英(1954-)，女，大学本科，教授，研究方向：食品营养与安全，E-mail:ydong@ujs.edu.cn。

江苏高校优势学科建设工程项目。

TS210.1

A

1002-0306(2017)10-0146-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.020