嗅鞘细胞移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用

王艳华，王东武



嗅鞘细胞移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用

王艳华1，王东武2

目的 研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs )移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用。方法 玻璃体腔α晶体蛋白注射，联合视神经损伤近端移植OECs，分为4个实验组，包括α晶体蛋白注射组、OECs移植组、α晶体蛋白注射+OECs移植组、PBS对照组。于视神经损伤并移植OECs+玻璃体腔注射药物后即刻、1周、2周、1个月、2个月、3个月，用全自动眼电生理仪进行闪烁视觉诱发电位(flash-elicited visual-evoked potential，FVEP)检测，分析比较各时间点各组P1波的振幅及潜时。结果 OECs移植组及α晶体蛋白注射+OECs移植组FVEP的P1波振幅于视神经损伤后1周[(8.49±1.19)μv, (9.33±2.54)μv]、2周[(8.85±1.92)μv，(9.43±2.41)μv]、1个月[(8.46±1.09)μv，(8.72±1.91)μv]、2个月[(8.12±1.41)μv，(8.48±1.67)μv]、3个月[(7.68±2.56)μv，(8.08±1.47)μv]，均显著高于对照组(P<0.01)，二者联合组P1波振幅恢复更为明显。3个实验组FVEP的P1波潜时与对照组比较，均无统计学差异。结论 OECs移植与α晶体蛋白均明显促进视神经损伤后FVEP电生理的恢复，其中，二者联合的作用最为明显。

α晶体蛋白；嗅鞘细胞；视神经损伤修复

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)及其伴随的嗅神经纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts，ONFs)移植，可明显促进脊髓及视神经损伤后神经的再生[1, 2]，但是视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells, RGCs)的神经纤维离开移植的OECs/ONFs形成的“髓鞘样”通道后，难以继续再生，更不能实现长距离再生到达视中枢[2]。玻璃体腔注射α晶体蛋白，也能促进视神经损伤后RGCs存活和轴突再生[3-5]，但是在视神经损伤后1个月促进再生作用基本消失[3]。笔者前期的研究发现，OECs移植联合α晶体蛋白能更有效地促进视神经再生[6]，但对视功能的修复尚缺乏研究。本实验通过大鼠视神经损伤后FVEP检测，研究OECs移植联合α晶体蛋白对视神经损伤后视功能的修复作用，进而为神经损伤和再生的基础研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 成年(250～300 g)Long Evans大鼠，雌雄不限。由第三军医大学实验动物中心提供，符合国家医用动物使用标准，标准号为清洁级，检证字SCXK(渝)20020003。

1.2 细胞培养及鉴定 参照文献[7]进行OECs/ONFs培养。取成年Long Evans大鼠(体重250～300 g)断颈处死，取出嗅球，取嗅神经层和外颗粒层用0.125%胰酶消化15 min，37 ℃。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，加入0.5%DNAse，吸管吹打10次后，1000 r/min，离心5 min。弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种至L-多聚赖氨酸包被的6孔培养板中，37 ℃恒温培养箱培养。第5天首次换液，余每3 d换液。培养第14天，细胞密度达1.5×106。参照文献[6,8]分别用兔抗大鼠S-100单抗 (1∶200, Sigma, 美国)鉴定OECs，小鼠抗大鼠纤维连接蛋白鉴定ONFs(1∶200, Santa Cruz Biotechnology, 美国)。二抗为山羊抗小鼠IgG-FITC和山羊抗兔IgG-cy3 (Boster, 中国)。

1.3 大鼠视神经钳夹伤模型制作及实验分组 参照文献[4]进行视神经夹伤及注射。每组6只，共24只实验大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定于手术台，手术显微镜下剪开大鼠手术眼上穹隆结膜约120°，避开涡静脉，钝性分离暴露视神经，在眼球后1 mm处，用11号尖刀沿视神经纵轴方向纵行挑开视神经鞘膜长4～5 mm，避免损伤视神经，用中号无创血管夹在球后2 mm处钳夹视神经10 s，钳夹伤后即刻，在夹伤近端，用35 G的NF35BV-2针头垂直视神经注射OECs(浓度1×106/ml)单细胞悬液或0.01 M的PBS，注射量3 μl，注射速度要缓慢，约40 s注完，注射结束后，留针2 min再拔针。术后载玻片轻压角膜，镜下观察眼底，无缺血者纳入实验。α晶体蛋白(10-4g/L，5 μl)或PBS(0.01 M,5 μl)用10μl的微量进样器于距离视乳头约2 mm的巩膜壁上，垂直于视神经纵轴刺入玻璃体腔。术毕分层缝合。术后大鼠术眼涂托百士眼膏，送西南医院动物所饲养。实验分为4组：(1)OECs移植+α晶体蛋白注射组；(2)OECs移植组；(3)α晶体蛋白注射组；(4)PBS对照组。

1.4 FVEP电生理检测视神经功能 于视神经损伤前、视神经损伤并移植OECs+玻璃体腔注射药物后即刻、1周、2周、1个月、2个月、3个月进行FVEP检测。电生理检查参照临床视觉电生理标准[9]，大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，安放电极(记录电极置于枕后隆凸皮下，参考电极置于双眼连线中点皮下，接地电极置于鼠尾皮下)，暗适应5 min，采用全视野刺激球白色闪光刺激，记录FVEP。应用RETI-port 软件测量潜伏期和幅值。每组6只大鼠，共24只大鼠。

2 结 果

2.1 OECs培养 培养的细胞主要由S100阳性的细胞和fibronectin阳性的细胞构成。S100阳性的细胞呈梭形，或三角形，称其为雪旺样细胞；而fibronectin阳性细胞为扁平，不规则形，称其为星形样细胞，两者相互交错混合生长，无明显分界。培养2周时，两者之间的数目比例约为1∶1(图1)。

图1 大鼠嗅鞘细胞培养2周形态

A.相差×200；B. S100, fibronectin染色，S100为红色，fibronectin为绿色。标尺50 μm

2.2 OECs与α晶体蛋白联合对视功能修复的影响 手术前，大鼠FVEP可见明显稳定的P1波(图2A)。视神经损伤同时进行OECs损伤局部移植及α晶体蛋白注射后，P1波变得低平，潜时延迟(图2B，表1)。术后7 d、14 d，OECs、α晶体蛋白及二者联合组P1波振幅明显恢复(P<0.01)，而对照组无明显恢复(图2C、D，表1)。术后1个月，3个实验组P1波振幅较损伤14 d有所下降，但与对照组相比仍有统计学差异(P<0.05) (图2E，表1)。术后3个月，3个实验组P1波振幅进一步降低，特别是α晶体蛋白组P1波振幅下降更为明显，与对照组比较，差异无统计学意义，但OECs组及二者联合组与对照组相比仍有统计学差异(P<0.01) (图2F，表1)。术后各时间点，3个实验组P1波潜时较术前均明显延迟，且与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。

指标例数0h7d14d1个月2个月3个月P1波振幅(μv) OECs组64．6±1．38．5±1．2②8．8±1．9②8．5±1．1②8．1±1．4②④7．7±2．4②③ OECs+晶体蛋白组64．5±1．79．3±2．5②9．4±2．5②8．7±1．9②③8．5±1．7②④8．1±1．5②④ 晶体蛋白组64．3±2．08．3±2．6②8．3±2．6①6．6±1．2①5．2±1．44．9±1．8 PBS组64．4±1．34．8±1．75．1±1．94．2±2．24．4±1．34．4±1．3P1潜伏期(ms)OECs组6100．4±13．097．5±10．196．3±15．795．0±19．5121．8±10．8101．6±9．5 OECs+晶体蛋白组6102．9±10．998．4±11．6101．7±7．697．3±12．3114．6±15．5103．2±14．6 晶体蛋白组6104．9±11．199．5±11．991．3±13．989．8±11．9104．3±17．1105．8±16．9 PBS组6102．4±10．3102．7±12．195．0±16．098．6±20．9121．8±15．2113．5±15．9

注：与PBS组比较，①P<0.05，②P<0.01；与晶体蛋白组比较，③P<0.05，④P<0.01

图2 视神经损伤同时行OECs移植、α晶体蛋白注射术前、术后各组FVEP波形

A.术前；B.术后当天；C.术后7 d；D.术后14 d；E.术后1个月；F.术后3个月

3 讨 论

OECs是嗅觉系统中特殊的胶质细胞，可分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性生长因子、睫状神经营养因子等多种营养因子[10]，对众多中枢神经元及RGCs具有保护和促进神经再生的作用，为治疗脊髓和视神经的损伤提供了新的希望[2, 10-12]。虽然与脊髓损伤一样，视神经损伤局部OECs/ONFs移植同样使胶质发生重朔，并形成“髓鞘样”通道，保护神经再生到损伤远端，但是与脊髓损伤所不同的是，再生的RGCs轴突在离开OECs形成的“髓鞘样”通道进入损伤远端后，末端形成囊样膨大而不能到达靶中枢[2]，说明单纯OECs/ONFs移植存在局限性。具有热休克蛋白功能的α晶体蛋白，不仅能保护视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞及晶体上皮细胞的存活[13, 14]；而且对视神经损伤后RGCs的存活也具有显著的保护作用，RGCs存活率在视神经损伤后14 d可达95%[5]。此外，α晶体蛋白还具有明显的促进视神经再生的作用，玻璃体腔注射α晶体蛋白后，再生的轴突数比注射牛血清白蛋白组显著增多，且这一作用持续到视神经损伤后4周[3]。其机制是通过抑制轴突再生抑制物信号传导的共同作用点——RhoA的激活，干扰RhoA/Rock信号通路、防止生长锥的萎缩而促进轴突再生[4]。虽然α晶体蛋白能保护RGCs存活，并促进轴突再生，但在视神经损伤后4周其作用明显减弱，并且再生轴突只达到损伤区远端5 mm，没有实现长距离再生[3]，说明单纯应用α晶体蛋白也存在局限性。笔者最近的研究已证明，OECs移植联合α晶体蛋白能更有效的促进视神经再生[6]，但对视功能的修复尚缺乏研究。本实验通过大鼠视神经损伤后FVEP检测，研究OECs移植联合α晶体蛋白对视神经损伤后视功能的修复作用。

FVEP 是视网膜受到闪光刺激后产生的视觉电生理活动，反映RGCs至视皮层的信息传递及视皮层的电生理活动。主要以P1波的潜伏期及振幅为分析依据，潜伏期反映视神经髓鞘功能，视神经损伤时，发生脱髓鞘改变，传导速度明显减慢，表现为潜伏期延迟。振幅主要反映视神经视网膜接受光刺激的功能，并与靶中枢形成突触的数目有关，视神经损伤时，神经束内压力增高，神经纤维水肿，轴索传递视觉信息及运输营养因子的功能降低，表现为振幅降低[15, 16]。通过FVEP检测视功能情况，具有客观、无损伤、灵敏性好的特点。Sabel[17]研究结果说明，有10%的RGCs存活，就具备使视功能恢复的能力。Chow[18]和Galambos等[19]也证明，2%～3%的视神经纤维与外膝体存在突触联系，就能够具有较好的视功能。Hubel和Wiesel[20]发现，有1%的细胞存在反应，就能够产生一定的功能恢复。本实验结果发现，OECs移植、α晶体蛋白玻璃体腔注射，以及两者联合组，P1振幅于视神经损伤后7 d即有明显的恢复，OECs移植组及OECs与α晶体蛋白联合组，P1振幅恢复情况于视神经损伤后3个月仍非常显著，但α晶体蛋白组于视神经损伤后2个月P1振幅较损伤1周、2周及1个月下降明显，这可能与α晶体蛋白单次注射，保护RGCs存活及促进视神经再生作用持续短暂有关。与OECs移植组及α晶体蛋白组比较，各时间点OECs与α晶体蛋白联合组P1振幅恢复情况均最为显著，提示，OECs与α晶体蛋白联合能更有效地促进损伤视神经的功能修复。本实验各实验组的P1潜伏期均无明显的恢复，提示OECs与α晶体蛋白不能促进视神经纤维髓鞘化，与Li等[2]的研究结果相似，视神经横断局部移植的OECs能伴随视神经纤维生长，但未形成髓鞘。

本实验通过大鼠视神经损伤后FVEP检测，证明OECs移植与α晶体蛋白均明显促进视神经损伤后视功能的恢复，但二者联合的作用更为明显。为神经损伤和再生的基础研究提供理论依据，为神经损伤后再生及功能修复提供新思路。

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(2017-01-20收稿 2017-03-15修回)

(责任编辑 武建虎)

Synergistic effect of olfactory ensheathing cells and alpha-crystallin on visual function recovery of adult rats after optic nerve injury

WANG Yanhua1and WANG Dongwu2.
1.Taiyuan Aier Eye Hospital, Taiyuan 030000, China; 2.Department of Orthopaedics， Hospital 8650, the Chinese People’s Armed Police Force, Jinzhong 030600, China

Objective To investigate the synergistic effect of olfactory ensheating cells (OECs) and α-crystallin on visual function recovery of nerve injury in adult rats.Methods α-crystallin was injected into the vitreous cavity, and OECs were transplanted to the area of optic nerve injury. The function of optic nerves was assessed by flash-elicited visual-evoked potential(FVEP) at 1 and 2 weeks, 1 and 3 months, and immediately after OECs transplantation and α-crystallin injection.Results Compared to PBS, OECs, the combination of OECs and α-crystallin promoted the recovery of the amplitude of P1 wave at 1 week [(8.49±1.19)μv, (9.33±2.54)μv], 2 weeks [(8.85±1.92)μv，(9.43±2.41)μv],1 month [(8.46±1.09)μv，(8.72±1.91)μv], 2 months [(8.12±1.41)μv，(8.48±1.67)μv] and 3 months [(7.68±2.56)μv，(8.08±1.47)μv] after optic nerve injury (P<0.01). The recovery of the amplitude of P1 wave was much more significantin the combination of OECs and α-crystallin group than in other groups. In α-crystallin group, the amplitude of P1 wave partly recovered after 1 and 2 weeks, but decreased after 1 month, and was not significantly different from that of the PBS group after 3 months. The latency of P1 wave did not recover in OECs group, α-crystallin group, or in the combination group.Conclusions Compared to OECs and α-crystallin alone, the effect of the combination of OECs and α-crystallin on functional recovery is significant.

α-crystallin;olfactory ensheathing cells;visual functional recovery

国家自然基金青年基金(31100706)；中国博士后科学基金资助(2012M521872)

王艳华，博士后，副主任医师。

1.030000，爱尔眼科医院集团，太原爱尔眼科医院；

2.030600 晋中，武警8650部队医院骨科

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