牦牛衣原体灭活疫苗免疫试验研究

阚 威 蔡金山 晁易林 胡广卫 沈艳丽 赵全邦 河生德李 静 王晓润 王小红 李兆才 周继章

（①青海省动物疫病预防控制中心 西宁 810000 ②青海省海晏县动物疫病预防控制中心③青海省贵南县动物疫病预防控制中心④中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃 兰州）

牦牛衣原体灭活疫苗免疫试验研究

阚 威①蔡金山①晁易林①胡广卫①沈艳丽①赵全邦①河生德②李 静①王晓润①王小红③李兆才④周继章④

（①青海省动物疫病预防控制中心 西宁 810000 ②青海省海晏县动物疫病预防控制中心③青海省贵南县动物疫病预防控制中心④中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃 兰州）

为了解牦牛衣原体灭活疫苗在牦牛免疫后的抗体消长规律，本试验在青海省两个示范县贵南和海晏分别选择2个规模养殖户，筛选成年牦牛120头(40头未孕牛、80头怀孕牛)、犊牛各40头进行免疫试验。试验牛群于免疫后第7天、21、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330天采血后分离血清，采用间接血凝试验检测免疫后抗体效价。结果表明：免疫后第21天的抗体效价成年牛高于1∶256，犊牛高于1∶1024；免疫后90d内，抗体水平处于上升状态。免疫后第4～8个月抗体水平保持平稳时，第8个月，抗体水平开始下降，但仍成年牛和犊牛抗体滴度仍保持在1∶256的效价。由此可见，该疫苗免疫牦牛后免疫抗体产生早、效价高、持续期长，效果明显，对牦牛衣原体病可达到预防的效果。

衣原体 灭活疫苗 免疫效果

衣原体归于衣原体科衣原体属，流产嗜性衣原体是衣原体属的一个种，可导致多种动物共患的人畜共患病，它在动物界广泛流行。该病原体主要寄生在母畜的胎盘滋养层，可导致绵羊、山羊、牛胎儿流产，此外还可引起猪、马、兔、豚鼠、小鼠的流产。经研究确定，牦牛衣原体病是由流产嗜性衣原体感染牦牛引起的一种地方流行性的接触性传染病[1]，以妊娠母牛流产、早产、死产或产无活力犊牛为主要特征。根据2010年到2013年监测，青海省牦牛衣原体病血清学阳性率逐年升高，临床上流产率也随之逐年升高，危害日益严重。2013年4～5月贵南县塔秀乡牦牛发生暴发流产现象，血清阳性率58.5%；收集的14份流产物衣原体病原阳性11份，并分离到6株衣原体菌株[1]。2015年，胡广卫等[2]，在海晏、贵南、乌兰、玉树四县市，对往年流产严重的牛群进行血清学检测，四县合计检测859份，平均阳性率55.76%；4县共调查8个乡16个村的104个流产严重牛群的流产率，平均流产率高达22.0%。

本试验旨在了解牦牛衣原体灭活疫苗免疫牦牛的效果，为疫苗的推广使用提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验疫苗 牦牛衣原体灭活疫苗由中国农业科学院兰州兽医研究所和青海省动物疫病预防控制中心合作研发。

1.1.2 试验动物 试验动物初始感染状态筛查，采集所有试验动物的血清，做IHA检测感染抗体。选择衣原体感染抗体阴性牦牛作为试验动物。试验动物随机分组，包括成年牦牛、妊娠牦牛和牦牛犊的对照组，不同剂量免疫组，及免疫+攻毒组等。在贵南县、海晏县选择有流产现象的牛群免疫牦牛6000头。海晏县2群、贵南县2群牦牛进行衣原体疫苗牦牛衣原体本动物疫苗安全性试验、疫苗的最小免疫剂量试验、疫苗的免疫效力试验、疫苗的免疫抗体消涨规律研究试验。

1.1.3 检测试剂 衣原体病间接血凝(IHA)抗体检测试剂盒，生产批号150430，由中国农业科学研究院兰州兽医研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 牦牛衣原体灭活疫苗的制备 制备方法参照邱昌庆、周继章等[3]发表的文章进行制备。

1.2.2 疫苗安全性试验 在海晏县青海湖乡和甘子河乡实施。对断乳牦牛犊10头(2ml/头)和怀孕2个月以内母牦牛95头(4ml/头)，进行单一剂量接种安全性检验；对断乳牦牛犊6头(4ml/头)和怀孕2个月以内母牦牛20头(6ml/头)，进行超剂量接种安全性检验。检验是否出现不良反应，是否引起流产。

1.2.3 疫苗的免疫效力试验 选择经过免疫的成年牦牛5头、妊娠牦牛30头和5头犊牛，第21天，用1∶1、1∶10、1∶100倍稀释的衣原体疫苗种毒稀释液攻毒，检测免疫效力。

1.2.4 疫苗的最小免疫剂量试验 在海晏县甘子河乡实施。成年牦牛免疫1、2、4ml/头各免疫10头，共30头；犊牦牛免疫0.5、1、2ml/头各免疫10头，共30头，检测免疫保护力。通过本试验可给出一个合适的临床使用剂量。

1.2.5 疫苗的免疫抗体消涨规律研究试验 （1）分组及试验设计：将试验研究分为2个组，犊牛免疫组和成年牛免疫组。犊牛组和成年牛组免疫试验。自免疫后第7天间接血凝试验开始检测免疫抗体。（2）采血及血清制备。在免疫后第7、21、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330天，静脉采血，静置析出血清，将血清注入EP管内，-20℃保存待检。（3）抗体检测：按说明书要求：①铺板：用移液枪移取被检血清0.025ml加入第1孔，呈4倍递增稀释8孔(即1∶4～1∶65536)。第3孔弃去0.025ml，孔内液体量扔为0.075ml。同一板上同时设阳性、阴性和空白对照各孔。②加抗原：每孔内加稀释好的抗原0.025ml，置微型振荡器上振荡2min，盖上玻璃板在37℃作用2h判定结果。（4）结果判定：根据血凝结果，8孔凡红细胞沉积于孔底，集中呈1圆点的为不凝集，判为阴性。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以抖凝集的孔为滴度终点。

2 结果

2.1 疫苗的安全性

按试验所需剂量免疫后观察，连续3天测定体温、脉搏、呼吸，所有指标均正常，未发生流产现象，无任何不良反应。证明牦牛衣原体灭活疫苗安全可靠。

2.2 疫苗的免疫效力

试验结果表明30头妊娠牦牛未发生流产，保护率达到100%。成年牦牛和犊牦牛无任何不良反应。

2.3 疫苗的最小免疫剂量

图1 成年牦牛最小免疫剂量试验

结果表明：经免疫抗体检测，牦牛犊1ml免疫剂量、成年牦牛2ml免疫剂量就可以达到理想免疫效果。检测结果如下图1、图2所示：

图2 犊牦牛最小免疫剂量试验

2.4 疫苗的免疫抗体消涨规律

免疫后免疫采集第7、14、21、30、60～330天用间接血凝试验方法进行血清抗体的检测。试验结果：免疫后第21天，平均免疫抗体滴度达到1∶S256以上，至2015年7月，免疫抗体检测到210d，平均免疫抗体滴度达到1∶256以上，至2016年1月，免疫抗体检测到330d，平均免疫抗体滴度达到1∶64。疫苗免疫效果非常理想。

3 讨论与小结

（1）牦牛衣原体病是导致牧区牦牛流产的主要病之一，它的自然传播方式目前还不清楚。病牛和隐性带菌者是主要的传染源。牧区牛羊之间的相互传播也有可能。患病怀孕牛流产或产犊时，大量衣原体会随羊水排出体外污染环境，通过消化道和呼吸道感染其他健康牛[4]。青海省牦牛存栏量约570万头，占世界牦牛的三分之一多。牦牛产业是我省牧民赖以生存的物质基础和支柱产业，通过牦牛衣原体病灭活疫苗的研制和推广，采取免疫预防等综合防治，降低牦牛空怀率和流产率，提高仔畜成活率，保障牦牛产业的稳定发展。（2）目前我省牧区的牦牛衣原体病感染和危害日趋严重，全省普遍需要防治衣原体病，但是缺乏有效的防治疫苗和方法，全世界没有牦牛上使用的疫苗，这是牦牛衣原体病得不到有效防治的最根本的原因，牦牛衣原体病已成为影响牦牛正常繁殖和牦牛产业发展的瓶颈问题。本疫苗的成功研制为我省牦牛衣原体病的有效控制和牦牛养殖业的可持续发展提供了技术支持。（3）经测试，本疫苗给怀孕2个月以内的乳牛使用安全可靠。而妊娠牦牛在怀孕早期(60d内)比较容易感染衣原体，为了有效预防衣原体病，以在配种前1个月或配种后1个月内接种效果较好。根据牦牛牛衣原体病的流行特点以及疫苗免疫期和疫苗接种后动物体内抗体的消长规律，本疫苗的最佳接种程序是：繁殖母牛在配种前1个月或配种后1个月免疫；犊牛在断乳后l个月内免疫。

[1] Zhaocai Li, Yilin Chao, Jinshan Cai et al.Identification and Characterization of Chlamydia abortus Isolates from Yaks in Qinghai, China [J]. Volume 2015 (2015), Article ID 658519, 6 pages

[2] 胡广卫, 沈艳丽, 晁宜林等. 青海省牛羊衣原体病血清学调查[J].黑龙江畜牧兽医,2015,12∶ 101-102.

[3] 邱昌庆, 周继章, 程淑敏等. 乳牛衣原体病灭活疫苗的研制[J]. 中国兽医科学,2006,05∶ 343-347.

[4] Ehret W J, Schutte A P, Pienaar J G,et al. Chlamydiosis in abeef herd[J]. S Afr Vet Assoc，1975, 46(2)∶ 171-179.

S852.67

A

1007-1733(2017)06-0010-02

2017–02–21）

青海省科技厅项目《牦牛衣原体灭活疫苗研究与推广》

*通讯作者