超高压液相色谱-飞行时间质谱联用快速测定酒中3种甜味剂

洪 健，周大寨，唐巧玉

(生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000)



超高压液相色谱-飞行时间质谱联用快速测定酒中3种甜味剂

洪 健，周大寨*，唐巧玉

(生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000)

建立了超高压液相色谱-飞行时间质谱(UPLC/MS-TOF)快速、高灵敏度测定酒中3种甜味剂安赛蜜、糖精钠、甜蜜素的定量分析方法.不同类型的酒类样品经超纯水稀释后，以0.1%甲酸水-甲醇溶液作为流动相，采用等度洗脱方式在Endeavorsil C18(1.8 μm，100 mm×2.1 mm)色谱柱上进行分离，以电喷雾离子源ESI负离子模式下进行定性、定量分析.实验结果表明，在最佳条件下，3种甜味剂在7min内实现完全分离；方法的最低检测限(以信噪比S/N的3倍计)为1～8 μg/L，定量限(以信噪比S/N的10倍计)为3.33～26.7 μg/L；在1～320 μg/L的质量浓度范围内与峰面积线性关系良好，相关系数大于0.998；3种甜味剂在配制酒中的回收率为96.33%～104.16%，精密度(RSD)为0.17%～1.36%；在清香型白酒中的回收率为92.38%～100.36%，精密度(RSD)为0.98%～1.85%；在果酒中的回收率为99.97%～103.88%，精密度(RSD)为0.52%～1.59%.该方法具有灵敏度高，分析速度快，且重现性好的优点，可用于酒类样品中甜味剂的快速检测.

超高压液相色谱-飞行时间质谱；酒；甜味剂

安赛蜜(acesulfame, AK)、糖精钠(sacharin sodium, SA)和甜蜜素(sodium cyclamate, SC)是常用的人工合成食品添加剂，作为甜味剂，可改善食品口感，调节风味，提高食品品质.近年来，随着食品添加剂的广泛使用，甜味剂在食品中的应用越来越广泛，研究发现，糖精钠、甜蜜素等甜味剂的使用可能会损害肾功能，致癌致畸，对健康造成危害[1].我国在《食品添加剂使用卫生标准》GB2760-2014中明确规定了甜味剂的种类和限量标准[2].以酒类产品为例，该标准规定只允许在配制酒中添加少量的甜味剂，其他酒类产品禁止添加任何甜味剂.由于酒产品的种类繁多，部分厂家可能存在甜味剂使用不规范等问题，导致食品安全检测任务繁重.因此，建立甜味剂快速、准确的检测方法对于酒类安全控制具有重大意义.

目前，检测甜味剂的方法很多[3]，如高效液相色谱串联质谱法[1]、紫外分光光度法[4]、气相色谱法[5]、离子色谱法[6]等.其中紫外分光光度法、液相色谱法与气相色谱法灵敏度低，易出现假阳性[7]，液相色谱-质谱法具有高灵敏度和高选择性的优点，可实现安赛蜜、糖精钠和甜蜜素的同时检测[8-11]，但该方法存在检测速度慢、效率低等问题.虽然关于酒产品中甜味剂检测方法的报道有很多，但目前尚未见到利用超高压液相色谱-飞行时间质谱法(UPLC/MS-TOF)来检测酒产品中的甜味剂.UPLC/MS-TOF具有质量分析精确、灵敏度高、采集速度快、定性定量分析准确的功能.该仪器使用MassHunter工作站软件进行数据分析，其分析功能强大，可实现多种分析应用，包括小分子和大分子化合物的谱图分析、鉴定以及定性和定量.本文通过建立超高压液相色谱-飞行时间质谱法(UPLC/MS-TOF)同时测定酒类中三种常用甜味剂，为酒产品的监督和管理提供更快速便捷、准确可靠的理论依据.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

采用Agilent Technologies 1290超高压液相色谱和6224飞行时间质谱联用仪检测甜味剂，其配有电喷雾电离(ESI)源.通过Agilent Masshunter工作站和数据处理软件对信号进行采集和处理；实验用水为超纯水(Milipore, Bedford，MA，USA)；超声波清洗器(PS-30型 深圳市洁汇超声洗净设备有限公司).

安赛蜜(acesulfame，AK，国家标准物质有限公司，批号SB05-217-2008，1 mg/mL)，糖精钠(sacharin sodium，SA，国家标准物质有限公司，批号GBW(E)100166，1 mg/mL)，甜蜜素(sodium cyclamate，SC，国家标准物质有限公司，批号GBW(E)100173，10 mg/mL)；甲醇和甲酸均为色谱纯，购自DIKMA公司；酒类样品来源于公司送检样品.(A类为配制酒；B类为清香型白酒；C类为果酒).所有试剂使用前均用滤膜过滤(孔径：0.45 μm，直径：5 cm，购自上海市新亚净化器件厂).

1.2 实验方法

1.2.1 色谱分析条件

色谱柱：Endeavorsil C18(购自DiKMA公司，1.8 μm，100 mm×2.1 mm)；流动相：A相，甲酸-水溶液(0.1∶100，V/V)；B相，甲醇溶液；等度洗脱，比例为65%的甲酸水溶液，35%的甲醇；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL；色谱柱温度：30 ℃.

1.2.2 质谱分析条件

离子源：ESI电喷雾离子源；扫描方式：负模式扫描；干燥气温度：350 ℃，流速10 L/min；雾化器压力0.310 MPa，毛细管电压3 500 V，毛细管出口电压175 V，锥孔电压65 V；氮气：纯度不低于99.999 %；选择负离子(EIC)采集方式，其中采集速度为1.5 spectra·s-1，扫描范围m/z 50～3 000；选定的分子离子[M-H]-的质荷比分别为：161.993(安赛蜜)，181.999(糖精钠)，178.062(甜蜜素).

1.2.3 校准曲线的制作

3种甜味剂安赛蜜、糖精钠、甜蜜素标准品的母液质量浓度分别为1、1、10 mg/mL，分别以超纯水配置成1 μg/mL的标准储备液，糖精钠和甜蜜素置于4 ℃下保存，安赛蜜保存在-20 ℃，有效期为1月.临用前分别量取标准储备液并用超纯水逐级稀释成混合标准使用液，其中安赛蜜、糖精钠和甜蜜素混合标准液的质量浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、160、320 μg/L.按所设UPLC/MS-TOF条件进样5 μL，测定进样浓度与相应质谱峰面积的关系.

1.2.4 样品预处理

移取50 mL的酒类样品于烧杯中，沸水浴蒸发至少量液体，转移至10 mL的容量瓶中，用超纯水定容，混匀后过膜(孔径：0.45 μm，直径：5 cm)待测.若样品中甜味剂含量太高，则用超纯水稀释至线性范围内的质量浓度.

1.2.5 精密度与回收率的测定

向酒类样品中添加标准溶液，按照1.2.4的方法进行预处理，按色谱和质谱分析条件进行检测，对酒类样品进行加标回收实验，计算精密度和回收率.具体过程为：对样品进行预处理并稀释后，向样品中添加100 μg/L的甜味剂混合标准液，混匀，待测.每个加标样品做6个重复测定.

2 结果和分析

2.1 色谱条件的选择与优化

流动相的比例和种类在色谱分离中起着非常重要的作用.为了得到最佳分离效果，本实验对色谱的分离条件进行了一系列的优化.首先对流动相的选择进行了探索，分别对乙腈-水, 乙腈-水-甲酸，甲醇-水、甲醇-水-甲酸等组合体系进行对照实验.结果表明, 甲酸水-甲醇组合体系得到的色谱峰和质谱总离子流图效果相对更好，通过改变甲酸水-甲醇的比例，将有机相从25%调至35%，发现随着流动相中有机相比例的增加，3种甜味剂的流出顺序不变，但保留时间逐渐减小，为了在最短的时间内得到最好的分离效果，实验选择有机相比例为35%.同时该实验对等度洗脱与梯度洗脱的效果进行对比发现，运用等度洗脱能使3种待测物在7 min 内实现完全分离(图1).其次优化了流速、柱温对分离效果的影响，该实验对比了0.1～0.5 mL/min范围内的流速，发现流速为0.2 mL/min时, 三种甜味剂的分离效果最佳.同时，随着柱温的升高(20～35 ℃), 分析时间缩短.为了在最短的时间和最少的溶剂消耗中获得最佳的分离效率，最终确定以流速0.2 mL/min、柱温30 ℃为最佳实验条件.三种甜味剂标准品和A类样品的总离子流及选择离子流色谱图如图1所示.

图1 三种甜味剂标准品、样品的总离子流图及选择离子流色谱图Fig.1 The election current(EIC) and total ion current(TIC) mass chromatogram of three sweeteners and sample

2.2 质谱检测条件优化

在ESI的模式下，对3种甜味剂标准样品的质谱信号强度进行ESI+和ESI-电离模式的扫描.结果表明，3种甜味剂在ESI-模式下均有较强的质谱信号，而在ESI+模式下只有甜蜜素显示出质谱信号，但其质谱信号强度低于ESI-模式.因此该实验选用ESI-电离模式，图2为3种甜味剂的质谱图.

图2 3种甜味剂的质谱图Fig.2 The mass spectrum of three sweeteners

2.3 方法的线性范围、检出限和定量限

在对样品进行测定时，样品色谱峰的保留时间应该与标准品保持一致，由于UPLC/MS-TOF具有基质效应，基质在电离源雾化电离的程中，其对目标物的雾化电离会产生抑制作用.因此对背景进行扣除之后，在同样的条件下，得到的样品谱图中各离子相对丰度与标准溶液在相应浓度下得到的谱图进行对比，其最大相对偏差不能超过欧盟委员会中规定[12]的范围，以此来判断该样品中是否存在相对应的被测物.根据各目标组分的质谱特性，配置相应浓度的混合标准溶液，在选定的色谱和质谱的条件下进行测定，以待测物在质谱中的峰面积对标准溶液质量浓度(C，μg/L)进行线性回归，绘制标准曲线(图3).由图3可知，3种甜味剂在相应的测定范围内线性关系良好，其相关系数(R2)均大于0.998.利用在空白基质中添加标准品的方法，根据标准曲线最低浓度点的响应值进行推算，以信噪比S/N的3倍所对应化合物的含量作为检出限(LOD)，S/N的10倍确定为最低定量限(LOQ)，得到3种甜味剂的LOD和LOQ如表1所示.由表1可知，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素的检测限(LOD)分别为8、4、1 μg/L，定量限(LOQ)分别为26.7、13.3、3.33 μg/L.

图3 3种甜味剂标准曲线Fig.3 The standard curve line of three sweeteners

甜味剂线性范围/(μg·L-1)线性方程相关系数LOD/(μg·L-1)LOQ/(μg·L-1)安赛蜜26.7～500Y=0.0003x-7.69740.9994826.7糖精钠13.3～500Y=0.0002x-5.45200.9979413.3甜蜜素3.33～500Y=0.0001x-0.91690.999913.33

2.4 样品的回收率和精密度

通过向酒类样品中添加标准溶液来计算精密度和回收率(表2)，结果表明，在A、B、C三类样品中，添加标准品均得到了较好的回收率和精确度.3种甜味剂在A类样品中的回收率为96.33%～104.16%，精密度(RSD)为0.17%～1.36%；在B类样品中的回收率为92.38%～100.36%，精密度(RSD)为0.98%～1.85%；在C类样品中的回收率为99.97%～103.88%，精密度(RSD)为0.52%～1.59%.

表2 2种添加剂在酒类样品中的加标回收率及精密度(n=6)

2.5 样品测定

按照本实验所建立的方法，对某公司送检的6份酒类样品中3种甜味剂安赛蜜、糖精钠和甜蜜素进行了定性定量分析，检测结果见表3.在6个样品中，均检测出含有甜蜜素，其中配制酒与果酒中检出含量最多，在30.04 mg/L与37.84 mg/L之间，清香型白酒中甜蜜素含量较低，在0.017 mg/L与0.07 mg/L之间；检出含有糖精钠的样品1份，为清香型白酒，含量很低，为0.012 mg/L；在6个样品中，均未检测出安赛蜜，出现该种情况认为有两种可能：一是为了改善酒的口味人工添加了甜味剂，另一种可能是酿制或调制过程中的原材料本身就含有或添加了甜味剂.考虑到所测酒类样品均为公司送检样品，这说明在市场上销售的各种配制酒、果酒更有可能非法添加甜味剂.有些酒类样品的甜味剂为低剂量添加，有些甜味剂的添加则高于国家标准，需引起高度重视，应对潜在的食品安全风险.

表3 酒类样品甜味剂测定结果

3 结论

本文建立了超高压液相色谱-飞行时间质谱联用快速测定酒类产品中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素这3中甜味剂的分析方法，在流动相为0.1%甲酸-水，有机相比例为35 %，流速为0.2 mL/min，色谱柱温度为30 ℃，ESI-电离模式的条件下，3种甜味剂在7min内达到最佳分离效果，此方法的优势在于样品前处理简单，酒类样品的浓缩方便，可以对3种甜味剂进行同时检测并具有良好的回收率和精密度，降低了工作量，为酒类产品中低剂量、复合甜味剂的检测提供了快速准确的科学依据.

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责任编辑：高 山

Rapid Determination of Three Sweeteners Content in Liquor by Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HONG Jian,ZHOU Dazhai*,TANG Qiaoyu

(Hubei Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization,Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

A rapid and sensitive quantitative analysis method for three sweeteners (acesulfame, saccharin sodium and sodium cyclamate) in liquor samples by ultra-performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry (UPLC-TOF-MS) was established. After the sample was diluted by ultrapure water,a 0.1% formic acid water-methanol solution was used as the mobile phase and subjected to isocratic elution at Endeavorsil C18(available from DiKMA, 1.8 μm，100 mm×2.1 mm) , and the three kinds of sweeteners were determined by quantitative analysis by electrospray ionization source ESI negative ion mode. The experimental results show that under the optimal conditions,three sweeteners achieve full separation within 7 min.The detection limit (LOD, S/N=3) was 1.0～8.0 μg /mL,(LOQ,S/N=10) was 3.33～26.7 μg/L.There was a good linearity between the three sweeteners in the range of 1 ～ 320 μg / L,the correlation coefficient was over 0.998.the recoveries in the liquor samples of compound liquor were in the range of 96.33%～104.16%,RSD were in the range of 0.17%～1.36%;the recoveries in the liquor samples of flavor types liquor were in the range of 92.38%～100.36%, RSD were in the range of 0.98%～1.85%; the recoveries in the liquor samples of fruit liquor were in the range of 99.97%～103.88%,RSD were in the range of 0.52%～1.59%.The method is sensitive, adaptable and reproducible to the rapid determination of sweeteners in liquor samples.

UPLC-TOF-MS;liquor;sweetener

2017-04-10.

湖北省教育厅青年项目(Q20131908)；2014年度湖北省本科高校“专业综合改革”试点项目(2014029).

洪健(1989-)，女，硕士，主要从事植物生理生化的研究;*

周大寨(1976-)，男(土家族)，硕士，高级实验师，主要从事天然产物研究与开发的研究.

1008-8423(2017)02-0162-05

10.13501/j.cnki.42-1569/n.2017.06.012

TS262.3；TS261.7

A