青海大通牛新孢子虫病血清学调查

伊平昌 ， 李国平

(青海省大通县畜牧兽医站 ， 青海西宁810100)

青海大通牛新孢子虫病血清学调查

伊平昌 ， 李国平

(青海省大通县畜牧兽医站 ， 青海西宁810100)

新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neosporacaninum)寄生于宿主细胞内引起犬、牛等多种动物共患的一种原生寄生虫病，对牛的危害最明显，给养牛业带来了巨大的经济损失。新孢子虫主要寄生于中枢神经系统、肌肉、肝脏、脑及其他内脏组织中，家畜感染新孢子虫后主要表现为脑炎、肝炎、持续性肺炎等，怀孕母畜则多出现流产、产弱胎、死胎和木乃伊胎等，新生仔畜则多表现为四肢运动障碍和神经系统疾病[1]。犬、狼、山狗和红狐等犬科动物是新孢子虫的终末宿主[2]。新孢子虫的中间宿主种类较多，可感染牛、羊、禽类、灵长类及多种野生哺乳动物等；新孢子虫有两种感染途径即垂直传播和水平传播，牛在误食了被新孢子虫卵囊污染的食物后感染，通过垂直传播迅速在该牛群中散播，感染可持续多年[3]。截至目前，还没有十分有效防治新孢子虫病的药物或疫苗[4]。新孢子虫病流行于世界各地，广泛存在于挪威、澳大利亚、新西兰、中国等50多个国家。我国对该病研究起步较晚，自2003年刘群等[5]首次从奶牛血清中检出新孢子虫阳性抗体，随后在全国多地相继检出了羊、奶牛等动物感染新孢子虫病的报道。对新孢子虫病作出早期诊断，及时隔离淘汰患病家畜是有效的防制措施。

目前，酶联免疫吸附试验(ELISA)应用较广泛，主要用于血清和初乳中抗犬新孢子虫IgG抗体的检测，常用的ELISA抗原有Nc SAG1、Nc GRA7、Nc GRA2等[6]。有关于青海省动物感染新孢子虫方面的报道甚少，尤其是大通县地区牛感染新孢子虫病方面仍为空白。鉴此，笔者于2016年1月对大通县4个不同地区的200份牛血清样品和1个牛场的100份牛血清样品进行了新孢子虫抗体ELISA检测、诊断，获得了大通县地区有关牛新孢子虫病感染现状的实际数据，为进一步掌握大通县地区牛新孢子虫病的综合防控提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 血清样品 2016年1月分别随机采自大通县4个乡镇200份血样(其中向化乡50份，青林乡50份，青山乡50份，岗冲乡50份)和1个牛场的100份血样，共计300份血清样品。经牛尾静脉采血，摆成斜面，低温保存送回实验室，室温放置过夜或37 ℃静置0.5～1 h后，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，置-20 ℃冷冻保存，备用。

1.2 主要仪器 LED-3型超净工作台，购自苏州净化设备有限公司；PHS-3B型精密PH计、FA2014N型电子天平，购自上海精密科学仪器有限公司；85-2A型双向恒温磁力搅拌器，购自金坛市医疗仪器厂；TGL18M型台式高速冷冻离心机，购自长沙易达仪器有限公司；AUCMA低温保存箱、BCD-202K型冰箱，购自澳柯玛股份有限公司；722N型可见分光光度计，购自上海菁华科技仪器有限公司；IMARK型酶标仪，购自Bio-Rad Laboratories, Inc, Japan；DNX-9620型电脑洗板机，购自北京普朗新科技有限公司；精宏电热恒温培养箱，购自上海精宏实验设备有限公司；SPX-250B型生化培养箱，购自金坛市白塔金昌实验仪器厂。

1.3 主要试剂 牛新孢子虫抗体(Neosporiasis Ab)酶联免疫分析试剂盒(生产批号：2015010D05)，购自上海恒远生物科技有限公司，美国TSZ进口分装。

1.4 主要操作步骤 按严格牛新孢子虫抗体酶联免疫分析检测试剂盒的说明书进行操作，具体步骤省略。

1.5 计算和判定标准 试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00，阴性对照平均值≤0.10；临界值(CUT OFF)计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15；阴性判定：样品OD值<临界值(CUT OFF)者为牛新孢子虫抗体(Neosporiasis Ab)阴性；阳性判定：样品OD值≥临界值(CUT OFF)者为牛新孢子虫抗体(Neosporiasis Ab)阳性。

1.6 统计分析 利用Microsoft Excel 2003软件，对不同地区、品种和年龄的样本进行卡方检验，当P<0.05时差异显著，P<0.01时差异极显著。

2 结果

2.1 本次调查应用ELISA方法，对大通县向化、青山、青林、岗冲4个不同地区和1个牛场的300份牛血清样品进行牛新孢子虫病血清学检测。检测中阳性判定均值为1.372，阴性判定均值为0.084，试验成立。根据临界值作阴、阳性判定，结果表明，在大通县地区300份牛血清样品中共检出18份阳性血清，平均阳性率为6%；大通县向化、青山、青林、岗冲地区和某牛场牛新孢子虫阳性率分别为8%、12%、14%、2%和0%，大通县向化、青山、青林和岗冲地区均为牛新孢子虫病的流行地区，其中青山和青林地区流行较严重，某牛场的100份牛血清样品均未检测出阳性，见表1。

表1 大通县地区新孢子虫感染情况

2.2 不同品种牛血清样本新孢子虫病感染情况调查 本次试验对300份血清样本进行了新孢子虫抗体检测，并将不同的品种黄牛、奶牛和牦牛区分检测，见表2。结果表明，黄牛的阳性率为11.96%，奶牛的阳性率为3.47%，牦牛的阳性率为2.86%，不同品种牛间都易感，牛新孢子虫感染率最高的是黄牛，其次是奶牛、牦牛。

表2 大通县地区不同品种牛新孢子虫感染情况

2.3 不同年龄段间牛血清样本新孢子虫病感染情况调查 不同年龄段间的牛新孢子虫病检测结果，见表3。其中0～2岁的阳性率为3.06%，3～5岁阳性率为9.38%，6岁以上阳性率为6.52%，说明年龄越高易感性就越大，3岁以上年龄段牛比2岁以内牛感染率高4.37%。

表3 不同年龄间牛新孢子虫感染情况

2.4 大通县不同地区牛新孢子虫病感染对比情况 大通县向化、青山、青林和岗冲四个地区新孢子虫感染情况对比，见图1。如图1所示，青林和青山地区牛新孢子虫病感染之间差异不显著(P>0.05)，青林、青山与岗冲之间差异显著(P<0.05)。青林、青山、向化与岗冲之间牛新孢子虫感染率存在显著差异(P<0.05)。

图1 大通县不同地区牛新孢子虫病感染情况对比

3 小结与讨论

3.1 自1988年Dubey等[7]发现新孢子虫病以来，科学家们对牛新孢子虫病的研究方法取得了很大的进展，如检测抗原、抗体的免疫学诊断方法ELISA、聚合酶链反应(PCR)、间接荧光抗体试验与免疫组织检测等很多方法。近年来，检测牛新孢子虫病的方法很多，但操作方法复杂，不适合临床应用，而ELISA方法，操作简便、快速，且特异性和敏感性都较高，广泛应用于牛新孢子虫病检测[8]。本次试验应用美国TSZ进口分装的牛新孢子虫抗体(Neosporiasis Ab)酶联免疫分析试剂盒对采集的300头份牛血清样品进行牛新孢子虫病检测，结果检出了18份阳性血清样品，平均阳性总检出率为6%(18/300)。检测结果初步说明，在大通县检测的四个不同地区存在牛感染新孢子虫病的情况，且阳性率也略有不同，而在牛场未检出阳性，调查初步掌握了大通县地区牛新孢子虫病的感染情况。

3.2 在对大通县向化、青山、青林、岗冲四个不同地区和某牛场的300份血清样本进行牛新孢子虫病抗体调査研究中，向化、青山、青林、岗冲四个地区均是牛新孢子虫的感染地区，其中青山和青林地区感染较为严重，岗冲地区感染率最低，这可能与地理环境、饲养管理方式有关。试验中向化、青山、青林属于脑山地区以放牧为主，岗冲位于浅山地区饲养管理以夏季放牧和冬季舍饲为主，脑山地区阳性率高于浅山地区，说明放牧饲养牛对新孢子虫病更易感；牛场饲养方式主要为圈饲，饲养管理较正规，未检出阳性。在不同品种间牛新孢子虫病调查显示，黄牛阳性率髙于牦牛阳性率，说明牦牛的抗病能力高于黄牛的抗病能力。在不同年龄的牛血清中6岁以上的阳性率高于0～2岁的阳性率，说明成年牛更易感染此病。调查中发现阳性率较高的地区有犬存在，因犬既是新孢子虫的中间宿主也是终末宿主，造成牛感染新孢子虫病的机率就大，易感性增加。

[1] 郭俊林.犬新孢子虫病[J].北京农业, 2012(25):33.

[2] Gondim L F, Mc Allister M M, Pill W C,etal. Coyotes (Canis latrans) are definitive of Neospora caninum [J]. Vet Parasitol, 2004，34(2):159-161．

[3] Dubey J P, Schares G, Ortega-Mora L M. Epidemiology and control of neosporous and Neospora caninum[J].Clin MicrobiolRev, 2007, 20(2):323-367．

[4] 刘群,李博,齐长明,等. 奶牛新孢子虫病血清学检测初报[J].中国兽医杂志,2003,39(2):8-9.

[5] Dubey J P, Buxton D, Wouda W. Pathogenesis 0f bovine Neosporosis[J]. Journal of Comparative Pathology, 2006, 134(4):267-289.

[6] Jin C, Yu L, Wang Y,etal. Evaluation of Neospora caninum truncated dense granule protein 2 for serodiagnosis by enzyme-linked immunosorbent assay in dogs[J]. Experimental Parasitology, 2015, 157:88-91.

[7] Dubey J P, Carpenter J L, Speer C A,etal. Newly recog nized falal protozoan disease of dogs[J]. Am Vet Med Assoc, 1988, 192(9):1269-1285.

[8] 贾立军,张守发,鲁承.犬新孢子虫可溶性抗原分析及间接ELISA检测方法的建立[J].中国兽医杂志, 2009, 45(9):25-26.

2016-05-19

伊平昌(1979-)，男(蒙古族)，兽医师，博士，主要从事动物疾病诊断和防控工作，E-mail：yipingchang_111@126.com

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0529-6005(2017)05-0057-02