茶树精油电辅助加热熏蒸处理对草莓品质和相关酶类的影响

魏彦珍 ，邵兴锋，韦莹莹，许凤，王鸿飞

(宁波大学,食品科学与工程系,浙江 宁波,315211)

茶树精油电辅助加热熏蒸处理对草莓品质和相关酶类的影响

魏彦珍 ，邵兴锋*，韦莹莹，许凤，王鸿飞

(宁波大学,食品科学与工程系,浙江 宁波,315211)

为了减少精油用量、节约成本，对茶树精油采用电辅助加热的熏蒸处理方法，分析该方法对草莓果实贮藏期间品质和代谢相关酶类的影响。结果表明，0.001%的茶树精油熏蒸处理可以减缓可溶性固形物(total soluble solid ，TSS)含量和硬度的下降，维持果实表面的亮度和红度，减缓果实贮藏期间过氧化氢(H2O2)含量的上升，提高过氧化氢酶(catalase，CAT)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性，降低抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)的活性，对超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和β-1,3-葡聚糖酶几乎无影响。可见，电辅助加热茶树精油熏蒸处理可以在节约精油用量的同时，较好地保持草莓的品质，延缓果实衰老。

茶树精油；熏蒸；草莓；品质

草莓是种深受消费者的喜爱的水果。但草莓含水率高达90%～95%，组织娇嫩，且无外皮保护作用，在采收和贮运中易受损伤或微生物侵染而腐烂变质，极不耐贮藏[1-4]。目前，化学防腐剂在果蔬采后贮藏保鲜中的应用已十分广泛，但许多人工合成的化学防腐剂存在诱癌性、致畸性和易引起食物慢性中毒等不安全问题[5]。在食品安全性越来越重视的今天，天然安全的食品保鲜剂的开发与应用显得尤为重要。

植物精油是植物的次生代谢产物，作为天然源保鲜剂的重要来源，具有较好的挥发性，以直接接触或熏蒸的方式在食物周围形成抑菌氛围，从而达到防腐保鲜的效果[6]。茶树精油(tea tree oil，TTO)具有良好的广谱杀菌抑菌和保健作用，并有宜人的肉蔻香气，是公认优良的天然芳香剂、抗菌剂、防腐剂，主要应用在日化、制药、食品等行业[7]。SHI等[8]发现，TTO抑制金黄色葡萄球菌，同时减少金黄色葡萄球菌肠毒素含量。SZCZERBANIK等[9]研究发现，TTO在熏蒸条件下可不同程度的抑制多种果蔬病原菌的生长。CHUTIA等[10]认为植物精油熏蒸处理对水果的防腐保鲜作用效果明显好于浸泡等处理方法；邵兴锋等[11]发现，0.66 mL/L TTO熏蒸可对草莓起到较好的保鲜效果，但精油用量大、残留多。为了节约TTO的用量，本实验研究电辅助加热的TTO熏蒸保鲜草莓，分析该处理方式对草莓常温贮藏期间果实品质和相关酶类的影响，以期为植物精油的商业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试草莓采摘于浙江省宁波市江北区的草莓种植基地，品种为＂红颜＂。采摘时，选择大小相对一致的果实。早晨采摘后立即运送回实验室，挑选无机械损伤、无病虫害的正常商业成熟度的果实。

NaCl，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O，抗坏血酸(均为分析纯)，邻苯二酚(化学纯)国药集团化学试剂；H2O2(30%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TTO由福州美乐莲生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

LE2002E/02电子天平、FE20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；90-3双向定时磁力搅拌器，上海青浦沪西仪器厂；UV-1600型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；GY-1型果实硬度计，杭州托普仪器有限公司；WYH型手持折射糖度仪，泉州光学仪器厂；CR-400色差仪，柯尼卡美能达公司。

1.3 处理方法及分组

1.3.1 熏蒸装置的设计及浓度的选择

为了使精油充分挥发，本试验自主设计了简易熏蒸装置。装置由4个部分组成：8 L密封的塑料箱，20 W电热杯垫，培养皿和简易支架(图1)。为了促进精油的挥发，将精油加到培养皿上，立即密封箱体，打开电源通电30 min，随后关闭电源。密闭熏蒸12 h后，打开箱体通风以散发精油。

在预实验中，分别尝试了0.001%、0.003%、0.005%、0.01%、0.03%、0.06%、0.09%的浓度梯度和2、3、4、12 h的时间梯度。综合考虑药伤、品质变化等，最终选择0.001% TTO熏蒸处理12 h。

图1 TTO电辅助加热的熏蒸装置Fig.1 Fumigation device for TTO electric auxiliary heating

1.3.2 草莓熏蒸处理

将草莓果实随机分成2组：第1组为熏蒸组(TTO)，将草莓果实置于装有加热装置的保鲜盒中，加入80 μL TTO(0.001%，v/v)密闭熏蒸12 h。熏蒸结束后将果实置于(20±1) ℃环境中贮藏以模拟货架期4 d。第2组果实为对照组(CK)，未作任何处理。每个处理组设3个重复试验，每个重复含90个果实；每天从每个重复试验组中取15个果实进行分析。样品用液氮速冻研磨成粉末，并于-40 ℃保存用于测定各项指标。

1.4 测定方法

1.4.1 硬度

硬度采用GY-1型果实硬度计测定，随机取5个果实，每个果实分别测定阴阳面赤道部位，重复10 次，取平均值[12]。

1.4.2 可溶性固形物(TSS)含量

采用手持折射仪测定。

1.4.3 可滴定酸(TA)含量

采用NaOH滴定法。称取10 g果肉，用均质机打成匀浆，加入10 mL蒸馏水，匀浆蒸馏水定容至250 mL，过滤收集滤液，用标准NaOH溶液滴定，结果以柠檬酸百分数表示[13]。

1.4.4 果实颜色

采用 CR-400 色彩色差仪测定表示果实表面色泽的L*、a*值。L*值代表亮度，a*值代表红绿度。

1.4.5 腐烂指数

腐烂指数的测定参照LIU等[14]的方法并做调整。按腐烂面积大小将果实划分为5级：0级，无腐烂；1级，腐烂面积占果实面积的0 ～ 25%；2级，腐烂面积占果实面积的25%～50%；3级，腐烂面积大于果实面积50%～75%，4级，腐烂面积大于果实面积75%。计算公式为：(0×N0+1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/(4×N)，N0、N1、N2、N3、N4、分别为各级腐烂个数，N为总的草莓个数。

1.4.6 过氧化氢和抗氧化相关酶类活性的测定

过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性的测定参照Pedro等[15]的方法，以每分钟酶促反应体系吸光度变化0.01为一个APX活力单位(U)。过氧化氢酶(catalase，CAT)活性的测定参照田平平[16]的方法，以每分钟酶促反应体系吸光度变化0.1为1个U。

1.4.7 抗病相关酶类的活性测定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)参照CAI等[17]的方法。β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)酶活参照WANG等[18]的方法。PAL以每小时酶促反应体系吸光度变化0.01为1个U。β-1,3葡聚糖酶以每小时从昆布多糖中释放出1 μmol葡萄糖所要的酶量为1个U。PPO每分钟酶促反应体系吸光度变化0.01为1个PPO活力单位(U)。

1.5 数据处理与分析

采用Origin 8.0进行数据处理，SAS统计软件进行方差分析，用邓肯多重比较方法进行差异显著性分析。当P<0.05时，表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 TTO熏蒸处理对草莓硬度的影响

硬度是评价草莓果实品质的重要指标。如图2所示，随着贮藏时间的延长草莓果实的硬度呈先小幅上升后下降的趋势，TTO熏蒸能减缓硬度的下降。在贮藏的第4天，对照组草莓硬度为3.9 N，而处理组为4.7 N，显著高于对照果实(P<0.05)。

图2 茶树精油熏蒸处理对草莓硬度的影响Fig.2 Effects of tea tree oil fumigation on hardness of strawberry fruit

2.2 TTO熏蒸处理对草莓TSS和TA含量的影响

果实TSS和 TA 含量是评价果实风味的的重要指标。在贮藏期间，草莓果实的TSS随着时间的延长而降低(图3A)，TTO熏蒸可以减缓TSS的减少，且在第4天，处理组显著高于对照组(P<0.05)。由图3B可见，处理组草莓果实的 TA 含量低于对照组，且在贮藏的第2和第3天，均有明显差异(P<0.05)。

图3 茶树精油熏蒸对草莓TSS(A)和TA(B)的影响Fig.3 Effects of tea tree oil fumigation on the TSS(A) and TA(B) of strawberry fruit

2.3 TTO熏蒸处理对草莓果实颜色的影响

从L*、a*值可以看出草莓果实表面色泽的变化。如图4A所示，L*值随着贮藏时间的增加而增加，且对照组高于处理组。在贮藏过程中，草莓表面a*值在贮藏前期升高(图4B)，后期逐渐降低。从第2天起，处理组的a*值显著高于对照组(P<0.05)，且在第3天时高出15%。

图4 茶树精油熏蒸对草莓果实颜色L*值(A)和a*值(B)的影响Fig.4 Effects of tea tree oil fumigation on L* value (A) and a* value(B) of strawberry fruit color

2.4 TTO熏蒸处理对草莓腐烂的影响

采用腐烂指数这一反映腐烂发生和严重程度的综合性指标来体现草莓贮藏过程中的自然腐烂(图5)。贮藏2 d后，处理组和对照组果实均可见果实腐烂的发生。随后腐烂指数逐渐增加，TTO熏蒸处理组的腐烂指数一直低于对照组。在第4天时，对照组的腐烂指数显著高于处理组(P<0.05)，且高出38%。对照组在室温下贮藏3天后，腐烂指数就接近0.3，而处理组是在第4天才达到0.3以上。

图5 茶树精油熏蒸对草莓腐烂指数的影响Fig.5 Effects of tea tree oil fumigation on the decay index of strawberry fruit

2.5 H2O2含量、SOD、CAT和APX活性的变化

在整个贮藏过程中，H2O2含量随着贮藏时间的增加而升高(图6A)。与对照组相比，TTO熏蒸处理后草莓果实H2O2含量一直保持在较低的水平，这表明TTO熏蒸有利于抑制H2O2含量。在贮藏的第2天和第3天，处理组H2O2含量分别比对照高11.4%和21.9%(P<0.05)。草莓采后SOD活性呈现先升高后下降的趋势(图6B)。除第3天时处理组SOD活性显著低于对照组(P<0.05)外，其他时间点2组均无显著差异。如图6C所示，草莓的CAT活性整体上是先升高后下降。在采后贮藏的第2天，处理组的CAT活性比对照组高158.4%，而在第3天时，处理组CAT活性比对照组高19.0%，均有显著差异(P<0.05)，但在其他时间上均无显著差异。APX 也是清除H2O2的重要酶。如图6D所示，对照组和处理组APX活性的变化趋势大致相似。与对照组相比，处理组的APX活性在第2、3天时显著(P<0.05)低，但在其他时间点无显著差异。

图6 茶树精油熏蒸对草莓H2O2含量(A)、SOD(B)、CAT(C)和APX活性(D)的影响Fig.6 Effects of tea tree oil fumigation on the content of H2O2(A) and the activity of SOD(B), CAT(C) and APX (D) in strawberry

2.6 PAL、PPO和β-1,3-葡聚糖酶活性的变化

从图7A可知，在整个贮藏过程中，对照组PAL活性先升高后下降，而处理组的PAL的活性一直维持在一个稳定的状态，且对照组PAL活性一直高于处理组。从图7B可知，在贮藏1 d以后，处理组的PPO活性高于对照组，且在第2天和第4天时差异显著(P<0.05)。从图7C可知，2组果实的β-1,3-葡聚糖酶活性都是先升高后下降的趋势，且均在第3天达到峰值。对照组酶活性在第3天时显著(P<0.05)高于处理组。

图7 茶树精油熏蒸对草莓PAL(A)、PPO(B)和β-1,3-葡聚糖酶活性(C)的影响Fig.7 Effects of tea tree oil fumigation on the activity of PAL (A), PPO (B) and β-1,3-glucanase in Strawberry

3 讨论

草莓是一种非呼吸跃变型果实[19]，采后没有后熟作用。所以为了达到其最佳的食用品质，一般在完全成熟时采收。在销售过程中，能引起消费者购买欲望的第一商品价值指标应该是外观和硬度，口感是购买后消费产生的第二商品价值[20]。因此，维持草莓的外观品质和口感就尤为重要。本研究结果表明，TTO电辅助加热熏蒸处理可以有效地维持草莓果实的硬度和亮度，并维持草莓的红度，从而使草莓保有诱人的光泽度。同时还对维持可溶性固形物的含量的降低和可滴定酸的含量有一定作用，使得处理后的草莓保有较好的口感。同时，TTO熏蒸能有效降低草莓果实的腐烂。这与程赛等[21]研究2 000 mg/L TTO熏蒸可以维持草莓品质、降低草莓腐烂的结果一致。但是程赛实验中TTO用量较大，且自然熏蒸处理后还有大量的精油残留，造成浪费。本研究采用电辅助加热的方法，促进精油的挥发，极大的降低了TTO浓度(仅为0.001%)，也能发挥较好的保鲜作用，并延长货架期。

果实衰老是由于果实机体内活性氧生成能力增强而清除能力下降, 从而使活性氧水平升高, 促使细胞发生膜脂过氧化而引起膜降解导致果实伤害[22]，加速衰老。LAKIMOVA等[23]研究发现NO能显著减少H2O2的含量，并在贮藏期间一直保持较低水平，这与延长货架期和降低电解质渗透率相关，从而减缓衰老。GAO等[24]研究发现褪黑素能减少桃果实中H2O2含量，也与减缓衰老相关。植物在逆境胁迫下,体内活性氧产生和清除系统间的平衡被打破,因此SOD、CAT和APX活性的变化反映了植物在逆境下通过自身对环境胁迫做出保护性应激反应[25]。SOD能清除超氧阴离子过多造成的毒害作用，在生命体的自我保护系统中起着重要的作用。H2O2的清除则由 CAT、APX 等酶的共同反应完成。本实验中，TTO电辅助加热熏蒸处理使草莓果实H2O2含量保持在较低水平，说明该处理较好的延缓了果实H2O2的积累，延缓衰老进程。WANG等[18]研究发现,热空气处理可以通过保持更高的SOD、CAT和较低的APX活性可以减少甜樱桃青霉腐烂。SHAN等[26]研究发现LaCl3处理可以通过提高抗氧化酶活清除过量的H2O2防止鲜切百合花的衰老。本研究结果表明，TTO熏蒸可以通过较高的CAT活性和较低的SOD、APX保持较低的H2O2含量，从而延缓草莓果实衰老，减少腐烂。

PAL、PPO和β-1,3-葡聚糖酶都参与植物的抗病防御机制。PAL对生物合成酚类、植物抗毒素及木质素有重要作用；β-1,3-葡聚糖酶是重要的病程相关蛋白，可以分解病原菌细胞壁；而PPO则可以通过氧化酚类成为有抗菌作用的醌。吴新[27]发现异硫氰酸烯丙酯精油虽然不能提高抗病相关酶活，但是它的抑菌效果好。同时，ARREBOLA等[28]也发现植物精油(百里香精油和柠檬草精油)可减少桃果实腐烂，但并没有提高抗病相关酶活。但是，SHAO等[12]研究发现0.9 g/L TTO提高了草莓的诱导抗性。本研究采用较低浓度TTO熏蒸对草莓进行处理，没能有效提高草莓果实的抗病性，但依然可以减小腐烂指数，这主要是由于TTO对病原真菌的直接抑制作用。

4 结论

本实验通过研究，发现0.001%的TTO电辅助加热熏蒸能一定程度维持草莓贮藏品质，减少果实采后腐烂，延缓草莓衰老，延长果实贮藏期。探究改进传统熏蒸方法，能极大地减少TTO的用量，在发挥防腐保鲜效果的同时，节约了使用成本。这将更有利于该技术在生产实际中的应用。

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Effect of tea tree oil electric auxiliary heating fumigation on quality of strawberry fruit and its related enzymes

WEI Yan-zhen, SHAO Xing-feng*, Wei Ying-ying, XU Feng, WANG Hong-fei

(Department of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211,China)

In order to reduce the amount of essential oil and save the cost, effects of electric auxiliary heating tea tree oil fumigation on fruit quality of strawberry fruit and related metabolic enzymes during its storage were investigated. The results showed that the 0.01‰ tea tree essential oil fumigation treatment could inhibit the decrease of total soluble solid (TSS) content and hardness, and maintain the brightness and red color of the surface of the fruit. The treatment also reduced hydrogen peroxide (H2O2) content, increased the activity of catalase (CAT) and polyphenol oxidase (PPO), and reduced the activity of ascorbate peroxidase (APX) and phenylalanine ammonia lyase (PAL). It had almost no effect on the superoxide dismutase (SOD) and β-1,3-glucanase. Thus, the improvement of electric auxiliary heating tea tree oil fumigation treatment could not only greatly save the amount of essential oil, but also maintain the quality of strawberry and delay fruit senescence.

tea tree essential oil; fumigation; strawberry; quality

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704021

硕士研究生(邵兴锋教授为通讯作者，E-mail:shaoxingfeng@nbu.edu.cn)。

国家自然科学基金(31371860)；浙江省公益技术应用研究(2017C32010)；宁波市农业和社会发展攻关项目(2014C50084)

2016-08-02，改回日期：2016-09-01