贮存过程中大曲原核微生物多样性及土味素含量变化规律

杜海,杜小威,赵景龙,张鑫,徐岩

1(江南大学, 酿酒科学与酶技术中心, 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)2(山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心，山西 汾阳，032205)

贮存过程中大曲原核微生物多样性及土味素含量变化规律

杜海1,杜小威2,赵景龙2,张鑫2,徐岩1*

1(江南大学, 酿酒科学与酶技术中心, 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)2(山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心，山西 汾阳，032205)

通过对不同贮存时期大曲的微生物群落结构的分析，进一步阐述了大曲的贮存过程的必要性。采用MiSeq高通量测序方法，鉴定出原核微生物119个属。其3种大曲相对丰度靠前的优势菌属主要为乳酸菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、链霉菌属、短杆菌属等。随着贮存时间的推移，3种大曲的物种多样性都处于上升趋势。在各个阶段高温曲的物种丰度和多样性都高于清茬曲和红心曲，说明高温曲的制曲工艺使得微生物生长更活跃。分析3种大曲中链霉菌与土味素的含量变化趋势，在贮存3个月时，两者的含量相对较低。因此，从异味控制的角度来看，大曲贮存3个月左右的时间更利于白酒风味的形成。

大曲贮存；MiSeq测序；微生物群落；链霉菌

中国白酒历史久远，是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒。大曲在白酒酿造过程中有着举足轻重的地位，其中栖息着丰富的微生物种属(比如细菌、酵母及霉菌等)[1]，其作为白酒酿造过程中微生物及生物酶的有效载体，在白酒酿造中起着糖化、发酵、生香的作用，因此，大曲质量的好坏会直接影响到白酒的产量以及质量。大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块，大小不等，让自然界各种微生物富集生长而制成[2]。

清茬、红心、高温这3种大曲在培养的过程中存在差异，具体来说是3种曲在培养温度上各有不同[3]。因而其生化性能与微生物的数量也有较大的差异性，而这些差异与工艺是相一致的。据目前的研究，在贮存3个月后，清茬曲的糖化力、液化力和蛋白酶均高于另两种大曲。而红心曲中的细菌含量最高，清茬和高温曲中总的酵母和霉菌的含量比较高[4]。3种大曲若单独发酵，出酒率是高温曲最高，清茬曲次之，红心曲最低。而将3种大曲按照一定比例混合(3∶3∶4)，则出酒率会得到提高。3种大曲混合可以取长补短，菌种较多后，各种营养的成分才能尽可能地被各种微生物利用，进而代谢出各种产物，提高出酒率的同时也能提高其质量和风味[5]。同时，大曲白酒中除香气成分以外，还存在着许多像糠嗅味、涩苦酸等常见的不愉快气味[6]。其中，糠嗅味则在清香型白酒中表现更为突出。研究表明，产生这一异味的源头为大曲中链霉菌代谢的土味素[7]。研究制曲过程分析土味素产生菌变化规律以及其他微生物之间的相互作用，对于白酒风味提升以及品质稳定性的提高有重要意义。

根据文献记载，PCR-DGGE技术在21世纪初开始运用到大曲微生物的研究中，使人们更近一步地认识大曲中的微生物的分布[8]。CHEN等人采用PCR-DGGE技术，共检测到了11株细菌、9株杆菌和7株真菌，其中优势菌群有枯草杆菌和米曲霉[9]。利用PCR-DGGE技术来研究大曲中的微生物，能够提供微生物群落中比较详细的种类信息并且可以同时去分析多个样品，但弊端是实验操作很繁琐，对微生物多样性的认识比较有限[10-11]。近几年，因为高通量测序技术的发展，在微生态学研究中开始大规模地使用二代测序技术。ZHANG等人利用二代测序的技术，分析了清香型白酒3种大曲的微生物结构，为生产时大曲的添加比例提供了可靠依据[12]。但新曲中微生物种类丰富且生物量较高，导致投入生产的酒醅发酵前升温迅速，总酸度高。因此，出房大曲必须贮存于通风干燥的曲库。在此过程中，随着贮存时间的推移，3种大曲中所含微生物的结构也在不断发生变化。目前关于这些微生物结构的动态变化报道还相对比较少。

本研究以汾酒酿造用大曲为研究对象，通过提取大曲微生物总DNA、PCR扩增等预处理，以MiSeq高通量测序剖析大曲贮存过程中微生物群落结构变化；对微生物群落组成进行比较研究，以此分析各功能菌的变化趋势，从而进一步解析清香型大曲功能微生物，探究大曲最合适的贮存时间。

1 材料与方法

1.1 大曲样品

实验大曲样品取自某清香型白酒厂所产清茬曲、红心曲和高温曲，3种大曲均按照出房、贮存1个月、3个月和5个月一共4个时间点分别采集。为了保证取样的科学性以及均一性，出房时在5处取样，贮存1个月、3个月和5个月则随机选取3块大曲做平行样并放置在-20 ℃进行保藏。

1.2 样品前处理

取7 g大曲样品，加入20 mL无菌的0.1 mol/L PBS缓冲液(0.057 7 mol/L Na2HPO4，0.042 3 mol/L NaH2PO4)将样品悬浮，再加入玻璃珠平放漩涡振荡3 min使其充分混合。将混合样300×g转速下离心5 min，取上清液，沉淀用上述PBS缓冲液重复洗涤3次，再次离心后收集全部的上清液。上清液于10 000×g离心15 min，收集细胞沉淀。用5 mL PBS缓冲液将上述沉淀重复洗涤3次，直到洗液干净呈无色状态，再10 000×g离心10 min重新收集细胞沉淀。

1.3 大曲宏基因组提取

采用玻璃珠细胞破碎仪破碎细胞，苯酚氯仿抽提方法提取窖泥细菌基因组，具体方法参照文献[14]。

1.4 IlluminaMiseq测序及序列分析

利用引物对338F (5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GTGGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)，对上述大曲基因组进行PCR扩增，该对引物针对细菌16S rRNA基因序列中的V3-V4可变区进行扩增。将合并的PCR产物按照说明书TruSeq® DNA Sample Preparation Guide中的Low Sample (LS) Protocol进行文库制备，然后在Illumina平台上进行双端测序(2×250 bp)。然后将所得原始序列按照Ren等人的方法进行序列质量控制处理最终得到有效序列。本实验用QIIME′s uclust程序将相似度为97%有效序列归为一个OTU并确定每个OTU的代表序列。利用QIIME软件计算酒醅微生物群落的α-多样性信息，包括Shannon及Chao1指数。基于Weighted UniFrac距离对不同酒醅样品中微生物群落进行主坐标轴分析(PCoA)。将每个OTU的代表序列与Ribosomal Database Project (RDP)在线数据库进行比对，选取置信度为80%的阈值对上述序列进行分类，进而得到每个OTU的分类水平，即门、纲、目、科及属水平。

2 结果与讨论

采用MiSeq测序技术结合PCR技术对3种大曲样品进行定性定量分析，将测序结果所得到的原始的序列按照REN[15]等人的方法进行一个初步的处理，来控制质量，进而得到有效的序列。然后将每个OUT所代表的序列在NCBI的在线数据库里进行比对，选择匹配度最高的比对结果，进而进行分类，得到门、纲、目、科、属5个水平。基于以上处理结果，探究其在不同贮存时期微生物群落的变化，以此来区分3种大曲，以及每种大曲在不同时期的特点。

2.1 三种大曲贮存过程中微生物群落结构差异

为了更加全面地揭示3种大曲在贮存过程中微生物群落的组成以及多样性信息，本研究采用IlluminaMiSeq技术，对清茬、红心和高温曲不同贮存时间下微生物群落结构进行了分析。图1为3种大曲在不同贮存时间下针对原核微生物测序结果的稀释曲线。该曲线相对来说趋于平缓，说明本研究测序结果可以比较全面的覆盖应有的物种。

图1 不同贮存时间3种大曲中原核微生物测序稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of prokaryotic community in Daqu at different storage periods

表1中分析了3种大曲细菌的Chao1和Shannon指数。表中显示，随着贮存时间的推移，原核微生物多样性总体呈现先上升后下降的趋势。清茬曲和红心曲在贮存3个月的时候物种丰度和多样性达最高值，高温曲则在贮存5个月的时候达到最高。说明大曲贮存过程中微生物的群落多样性及结构在不断地进行调整变化。生物多样性与后期发酵风味的产生密切相关，各菌种相互平衡、协同作用，更利于发酵的进行。故而选择大曲适宜的贮存时间，同时要密切关注微生物结构的多样性，在多样性达到较高水平且稳定的时候较为合适。此外，在各个阶段高温曲的物种丰度和多样性都高于清茬曲和红心曲。说明高温曲的制曲工艺相对来说更适合多种微生物的生长繁殖。

表1 不同贮存时间3种大曲中原核微生物多样性分析

图2为3种大曲不同的贮存时间下原核微生物群落的PCoA分析。分析结果显示，不同大曲样品个体之间菌群结构的存在较大差异。但前期与后期大曲样品的细菌群落能分别较好在不同象限聚集在一起。其中整体规律为：清茬曲与高温曲的菌群结构较为相似。这两种大曲贮存起始时期样品可以较好地聚到一起。在贮存后期，3种大曲的样品有相似的菌群结构。说明3种大曲贮存过程中变化相对来说比较明显，存在差异性。红心大曲中存放过程中微生物结构变化较小。贮存过程中，物种的差异性逐渐减少对于大曲品质的控制和发酵优化的进行有着很重要的意义。

图2 三种大曲不同贮存时期原核微生物PcoA分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of prokaryotic microorganisms in three kinds of Daqu at different storage periods注：QC、HX、GW分别为清茬曲、红心曲和高温曲的简称；S0m表示贮存0个月即出房、S1m表示贮存1个月，S3m表示贮存3个月，S5m表示贮存5个月；S0m后数字为样品编号。

2.2 三种大曲中原核微生物结构变化趋势

从图3可知，从3种大曲中鉴定出9个门，其中最主要有3个门，分别为：厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacillus)。其他的如拟杆菌门(Bacteroidetes)等虽然也存在但含量很低。其中，厚壁菌门在3种大曲中的含量都是最高的。其在红心曲和高温曲中呈现减少的趋势，在清茬曲中总体呈现上升趋势。

变形菌门在清茬和红心曲中的含量总体来说比在高温曲中多，在清茬曲中总体呈现增加的趋势；在红心曲中总体呈下降趋势；而在高温曲中普遍较低，含量相比来说比较稳定。放线菌门与变形菌门的演替趋势正好相反，在高温曲中的含量比其他两个曲中的都要高，除在5个月时含量有所降低外，其他几个时期都比较稳定。

根据IlluminaMiSeq测序技术鉴定出的细菌一共有119个属，分别属于9个门，其3种大曲相对丰度靠前的优势菌属主要为乳酸菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、链霉菌属、短杆菌属等。选定相对丰度前20的属分析其变化趋势。随着贮存时间的推移，3种大曲中的微生物群落结构也各不相同。在清茬曲中，呈上升趋势的有明串珠菌属(Leuconostoc)。总体呈下降趋势的有葡萄球菌属(Staphylococcus)，魏斯氏菌属(Weissella)和链霉菌属(Streptomyces)；芽孢杆菌属(Bacillus)含量先降低后升高，贮存1个月时最低。一些菌属如短杆菌属(Brachybacterium)变化并不明显。在红心曲中，芽孢杆菌属先增加后减少，在贮存1个月的时候相对丰度最高；葡萄球菌属总体呈现降低的趋势，在出房时含量最高；乳酸菌属和魏斯氏菌属总体上呈现上升趋势。在高温曲中，芽孢杆菌先减少后增加，贮存1个月的时候含量相对较低，而魏斯氏菌属正好相反，先增加后减少，在1个月的时候含量最高。乳酸菌属持续增加后趋于稳定。葡萄球菌属持续降低后趋于稳定。短杆菌属总体呈现上升趋势。

乳酸菌广泛存在于自然界中[13]。在白酒发酵过程中，可赋予酒独特的香气和口味。同时可以控制酒醅酸度和升温，如果控制得当可以使酒醅的出酒率稳定。同时，乳酸菌生成的乳酸，以及通过与乙醇发生酯化反应再生成乳酸乙酯，可以赋予白酒独特的风格。当然，如果乳酸菌过多也会出现使酒质发闷、苦涩等缺点。芽孢杆菌属是白酒发酵中另一个主要的细菌属。芽孢杆菌属繁殖很快，在水分和氧气较多的软曲块中尤其迅速。而芽孢杆菌属中微生物普遍具有水解淀粉和分解蛋白质的能力。在发酵中起着增香、特别是改善汾酒后味的重要作用[14]。

总体来说，3种大曲细菌分布逐渐趋于平衡，随着贮存时间的推移，一些出房时相对丰度很高的菌属在逐渐降低，而相对丰度较低的则在逐步上升。说明各大曲的细菌分布随贮存时间的推移趋于合理，更利于后期发酵的进行。

2.3 探寻大曲中异味物质土味素与链霉菌相互关系

在白酒中，除了有各种香气成分以外，还存在着很多，比如土霉味、涩苦味等常见的一些不愉快的气味，这其中土霉味在清香型白酒中表现尤为突出。经研究表明，产生这种气味的物质主要为大曲带入的土味素(geosmin，GSM)，且产生土味素的主要功能微生物是链霉菌[7,15]。因此，研究清茬、红心和高温3种曲在不同贮存时期链霉菌相对丰度的变化趋势，可更合理的选择优质大曲，减少酿造过程中土味素的产生。图4为根据测序结果比对出的链霉菌的相对丰度以及检测到的3种大曲在不同贮存时期土味素含量的变化趋势。

由图4可以看出，在清茬曲中出房时链霉菌和土味素的含量均很高，随着贮存时间的推移慢慢降低，后稍有提高，在贮存3个月的时候土味素浓度最低，链霉菌含量也较低；在红心曲中，链霉菌和土味素先增加后减少，后又增加，在贮存3个月的时候两者含量相对来说比较低；在高温曲中，链霉菌基本呈现出递增趋势，土味素总体呈现出递减的趋势，且在贮存3个月的时候浓度最低，而此时链霉菌含量相对来说也不高，因此贮存3个月的时候两者含量相对来说比较低。

图4 清茬曲(a)、红心曲(b)和高温曲(c)链霉菌与土味素(GSM)含量S0m表示贮存0个月即出房、S1m表示贮存1个月，S3m表示贮存3个月，S5m表示贮存5个月Fig.4 Contents of Streptomyces and Geosmin (GSM) in Qingcha Qu (a), Hongxin QU (b) and Gaowen Daqu (c)

综合上述分析，链霉菌与土味素在误差允许的范围内基本呈现出正相关的关系，即土味素的浓度随链霉菌含量的增加而增加。结合3种大曲中两者的变化趋势，基本选定在大曲贮存期大于3个月的时候，链霉菌和土味素的含量相对较低，有利于降低酿造体系中土霉异味。

3 结论

3种大曲在不同贮存时期原核微生物的组成均存在差异性。高温曲中的乳酸杆菌属和芽孢杆菌属的含量相对来说高于清茬和红心。其3种大曲相对丰度靠前的优势菌属主要为明串珠菌属、葡萄球菌属、魏斯氏菌属、链霉菌属、乳酸菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属等。从微生物的富集以及平衡的角度来看，大曲贮存1～3个月左右的时间，可以为后续正常的发酵提供较为合适的动力和条件，更有利于酿造优质白酒。

大曲除了会为白酒发酵提供微生物外，也会对白酒的风味产生一定的影响。链霉菌产生的土味素是清香型白酒中土霉味的主要来源。分析3种大曲中链霉菌与土味素的含量变化趋势，在贮存3个月左右的时间时，两者的含量相对较低。因此，从异味风味控制的角度来看，大曲贮存3个月左右的时间更利于异味物质及其微生物的减少。

本研究利用高通量测序技术分析了清茬曲、红心曲和高温曲贮存过程中的微生物群落结构和演变规律。同时分析了影响白酒风味的土味素与其功能微生物链霉菌的相互关系，并探寻了大曲贮存的最适时间。但研究仅针对大曲中部分典型的功能微生物相对丰度变化趋势进行了定性分析，还需要进一步的完善和探究大曲中部分功能微生物对发酵产生的具体影响。

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Prokaryotic microbial diversity and geosmin content in the storage process ofDaqu

DU Hai1， DU Xiao-wei2， ZHAO Jing-long2， ZHANG Xin2， XU Yan1*

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Center for Brewing Science and Enzyme Technology, Wuxi, Jiangsu 214122, China) 2(Shanxi Xinghuacun Fen Liquor Technology Center, Fenyang, Shanxi 032205, China)

The necessity of storage ofDaquwas clarified by analyzing microbial community structure ofDaquduring different storage periods. 119 genera of prokaryotic microbe were identified using the method of MiSeq high-throughput sequencing. Dominant microbes which have a relatively higher abundance in three kinds ofDaqumainly wereLactobacillus,Bacillus,Leuconostoc,Weissella,Streptomyces,Brevibacteriumetc. Species diversity of three kinds ofDaqupresented a rising tendency as time goes on. Species diversity and abundance of GaowenDaquwere higher than those of QingchaQuand HongxinQu. It indicated that the craft process of GaowenDaquwas more suitable for the growth of microbes. Both the content of geosmin and abundance ofStreptomycesin the three kinds ofDaquwere found obviously lower in the third month of storage compared with the initial stage. Therefore,Daqustoring over three month was conductive to the control of off-odor.

storage ofDaqu; MiSeq sequencing; microbial community; streptomyces

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704001

博士(徐岩教授为通讯作者，E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金项目(31501469,31530055)；江苏省自然科学基金项目(BK20150143)；学科人才引进计划(111-2-06)中央高校基本科研基金(JUSRP11537)；中国白酒“3C”计划

2016-10-15，改回日期：2016-11-16