香糯竹组培技术研究

单 妍

(昆明医科大学海源学院，云南 昆明 651700)

香糯竹组培技术研究

单 妍

(昆明医科大学海源学院，云南 昆明 651700)

研究不同浓度的6-BA、不同激素种类、不同外植体、不同元素和不同土壤基质对组培试验的影响。试验结果表明：2.1mg/L的6-BA的种子发芽率最高；最适合的香糯竹外植体为半年生播种苗枝条；KH2PO4对于黄化苗的处理效果较显著，适合采用；移栽适宜的土壤基质为泥炭+红土+珍珠岩的混合基质。

香糯竹；组织培养；外植体;黄化苗;组培苗；种子发芽率；土壤基质

香糯竹(CephalostachyumpergracileMunro)产自中国云南及东南亚，在西双版纳州和思茅普洱地区栽培较广泛。已经有20多个国家引种该竹种。香糯竹秆丛生，直立，高达15 m，直径5～8 cm，梢端稍下垂，秆箨为光亮的栗褐色，厚革质。节间长30～45 cm，粉绿色。幼时密被白色贴身小刺毛，节下被白色柔毛，秆壁较薄，秆环平[1]。

香糯竹也称摇钱竹，其竹筒盛装大米、糯米，经蒸煮、烘烤熟后，竹腔内膜包裹在大米、糯米外围，既美观，又秀色可口，是上等佳肴。竹秆密集、挺拔、秀丽，是优秀的观赏竹；竹材结构细致，机械性能良好，是优秀的材用竹；竹材纤维含量高，篾性好，是优秀的造纸、竹纤维、编织原料；其竹片煮水，清香可口，为上等饮品；竹笋亦可食用。每年产值达30万元/hm2以上。

竹子虽然常见，但是竹子开花并不多见。大多数竹种开花结实周期较长，且具有十花九不孕的特性，所以其繁殖方式主要为无性繁殖，如母竹分株、竹枝扦插等。但这些方法存在着所需劳动力大，成本高，繁殖系数低等缺点，不能满足规模发展的需求。相较于传统的繁殖技术，组培技术具有繁殖系数大、快速、不受季节限制等特点，有较高的经济效益。研究表明，丛生竹的1个芽通过组织培养1年内至少可以繁殖10 000丛苗，而1株竹子用节育苗繁殖1年内只能繁殖5～10丛苗[2]，因此，在竹子繁殖方式上组培技术具极大优势。

1 研究地点

本研究地点为云南珍竹农业科技有限公司，嵩明县竹子科技园。

2 研究材料

2.1 外植体

外植体为香糯竹种子，香糯竹组培苗，实生苗枝条，成年竹枝条。

2.2 实验试剂

实验试剂包括氯化汞(0.05%～0.15%),75%酒精,生长调节物质(GA3、6-BA、NAA、IBA、IAA),KNO3,NH4NO3,KH2PO4,MgSO4。

3 试验方法步骤

3.1 试验材料的选取3.1.1 种子的选取

选取颗粒饱满的无霉、无虫害的优质香糯竹种子作为试验种子[3]。

3.1.2 枝条的选取

采取新鲜的不同的香糯竹枝条(半年生播种苗枝条、1年生播种苗枝条、2年生播种苗枝条、无性繁殖苗枝条、母竹枝条)作为组培材料。要求芽较多、无病虫，在不影响枝条正常生长存活的前提下，尽可能减少枝条的长度，这样可尽量减少污染，有利于提高存活率。

3.2 培养基的制备

竹类植物的组培试验所需的培养基通常为MS培养基。在试验过程中根据具体需要在培养基中添加不同的生长激素，配制不同浓度的培养基[2]。

MS培养基：大量元素(20 mg/L)，微量元素(5 mg/L)，铁盐(5 mg/L)，有机物(2 mg/L)，CaCl2(20 mg/L)，糖(30 g/L)，琼脂(4.5-5)g/L。

3.2.1 配制含有不同生长调节物质的MS培养基

MS培养基：生长调节物质(GA3、6-BA、NAA、IBA、IAA)，浓度根据各个培养阶段进行调整。

3.2.2 配制含有不同浓度的6-BA的MS培养基

MS培养基：6-BA(1.5 mg/L，1.8 mg/L，2.1 mg/L，2.4 mg/L)。

3.2.3 配制相同浓度的6-BA的MS培养基

MS培养基：一般采用1.5 mg/L的6-BA进行外植体丛芽诱导；2.0 mg/L的6-BA进行丛芽增值。

3.2.4 配制生根培养基

MS培养基：1.0 mg/L的6-BA和0.3 mg/L的NAA相结合。

3.3 培养基的灭菌

灭菌的仪器为立体式自动高压蒸汽灭菌锅。在温度为121℃的条件下，灭菌29 min[4]。灭菌结束后待培养基冷却凝固后便可使用。灭菌过程不宜过长，否则有机物分解，会失去营养作用，同时也会使培养基变质变色。

3.4 外植体的消毒3.4.1 种子的消毒

将选好的种子剥去外壳(避免损伤胚)，放入水中浸泡0.5 h。随后滤去水，将种子置于含量为0.1%的升汞中浸泡2～2.5 h。然后用无菌水冲洗种子3次，每次2～3 min。

3.4.2 枝条的消毒

将枝条置于无菌水中浸泡25～30 min，随后用无菌水冲洗枝条，洗去表面的异物杂质。随后放入0.1% 的升汞中浸泡10 min，最后用无菌水洗涤3次，每次2～3 min。

3.5 接种3.5.1 种子的接种

1)将种子接种在含有水和琼脂的培养基上进行初代培养，5～7 d后，待胚开始萌芽，将萌芽的种子转接入含有不同浓度的6-BA培养基(1.5 mg/L，1.8 mg/L，2.1 mg/L，2.4 mg/L)。

2)在超净工作台上进行接种，将消毒好的种子接种到含有相同浓度1.5 mg/L的不同生长调节物质(GA3、6-BA、NAA、IBA、IAA、对照CK)的培养基上，接种时尽量使种子表面干燥，倒出培养基表面的水，以防种子固定不稳。每个培养基接种5颗种子，过程中尽量避免污染。结束后做好标记和观察记录。

3.5.2 枝条的接种

在超净工作台上，将消毒好的枝条接种到含1.5 mg/L的6-BA的MS培养基上，接种时尽量弄干枝条表面的水。每个培养瓶接种3棵枝条，接种过程中应注意器皿的消毒，减少过程中的污染。结束后做好标记和观察记录。

3.6 培养条件

将接种好的种子、枝条放到培养室中。培养阶段试验室的温度需要控制在25～30℃；每日辅助光照10 h，光照强度约1600 Lx[5]。5～7 d种子、枝条开始萌芽，萌芽期间可初步判断受到污染的种子和枝条，应及时处理。

3.7 幼苗的转接3.7.1 种子幼苗的转接

转接的条件为当幼苗长出第3片叶子时[6]。在超净工作台内进行工作，把根剪去，同时打顶，留下1cm左右的长度，并转接到分化培养基(2.0 mg/L 6-BA)中，每瓶2～3棵。当种子幼苗长出2个或更多丛芽时，去掉种子。将分化的苗分成2～3株，用2.0 mg/L的6-BA继续培养。10～15 d后，由于培养基内的营养物质被消耗，需更换培养基，确保养分充足，植株正常生长[7]。

3.7.2 枝芽的转接

枝条上的芽在长到3～5 cm时打顶，去除顶端优势，保留1 cm左右长度，随后更换为2.0 mg/L的6-BA培养基，有利于丛芽的增值。培养20 d左右开始分化，待丛芽长到2～3 cm，去掉枝条，转接到2.0 mg/L 6-BA的培养基中，使其继续分化。随后10～15 d转接一次。

3.8 幼苗的生根

分化出一定数量的苗后就可以将长势良好、健壮、无污染的苗从培养基中分离出来，转接到生根培养基(1.0 mg/L的6-BA和0.3 mg/L的NAA)。细胞分裂素促进芽的增值，而生长素对根的生长有促进作用，所以结合使用效果较好[8]。每个培养瓶植株数量控制在3株，培养12 d左右，培养苗开始长根，记录根生长情况。

3.9 黄化苗的处理

将刚刚黄化的外植体取出，用无菌水冲洗干净，用0.1%的升汞消毒，随后立即放入含有不同营养元素的培养基中，观察30 d，记录生长情况。

3.10 组培苗的移栽3.10.1 炼苗

由于竹子组培苗适应外界环境的能力较弱，必须进行炼苗以提高移栽成活率。将生根的组培苗从培养室取出，移到覆盖有塑料薄膜和遮荫网的温棚内，敞开瓶口炼苗5～7 d，遮光度为80%～90%。每天中午11∶00—16∶00喷雾状水6次，保持基质和组培苗的湿度。每2 d喷洒一次磷酸二氢钾、尿素和多菌灵(50 g磷酸二氢钾+30 g尿素+520 g多菌灵，用15 kg清水稀释混合液)，同时注意保持基质含水量[9]。

3.10.2 移栽

将试管苗从培养瓶取出，洗去培养基，移栽到已消毒的基质(珍珠岩、蛭石、红土、黑土、泥炭土、腐殖土、泥炭+红土+珍珠岩)上，每天观察生长情况并记录。

3.10.3 施肥

在组培苗移栽成活后，采用不同的肥料和施肥方法施肥，观察试管苗的生长情况。采用的肥料有0.1%尿素、0.1%硝酸铵、0.3%NPK复合肥、0.6%过磷酸钙、0.2%磷酸二氢钾等，施肥方法有叶面施肥和地面施肥。

4 研究结果与分析

4.1 同种激素不同浓度对种子发芽率的影响

使用不同浓度的6-BA，探究对种子发芽率的影响,结果见表1。

表1 6-BA对种子发芽率的影响Tab.1 Effect of 6-BA on seed germination rate

表1数据为不同浓度的6-BA的MS培养基培养下种子的生长情况。从表中数据可以看出，在2.1 mg/L的浓度下种子发芽率最高，长势也最好。试验过程中，1.8 mg/L浓度下污染较为严重，导致发芽率降低。

4.2 不同激素对种子发芽率的影响

试验采用5种不同的生长调节物质，在浓度均为2.1 mg/L、培养条件相同的情况下进行组培试验，探究对种子发芽率的影响。记录结果并计算出不同激素情况下的发芽时间、产生病菌时间、发芽率、苗根数和苗高(表2)。

由实验数据得出，在培养条件相同的情况下，BA处理的种子发芽率最高，发芽时间也最短，不易产生病菌，苗长势最好，所以BA最适合促进种子萌芽。其次是GA3和NAA处理。

表2 不同激素的种子发芽生长性状Tab.2 Seed germination and growth traits in different hormone

BA为细胞分裂素，主要促进芽和根的形成，GA3为赤霉素，主要促进植物的生长发育，也能促进发芽；NAA是生长素类似物，主要促进植物生根。所以BA对种子的萌芽效果最好。

4.3 不同外植体的组培效果

试验选取了6种不同的外植体，在相同条件下进行组织培养。记录结果并计算出不同外植体的污染率、褐化率和成苗率(表3)。

数据显示，成苗率较高的3个外植体依次为半年生播种苗枝条、1年生播种苗枝条和种子。

种子不会发生褐化，但污染率较其他2种外植体高，也因为种子可能会发生变异，一般不采用。而半年生播种苗褐化率和污染率相对较低，最适合作为组培材料。母竹枝条发芽时间长，易污染，褐化率高，成苗率低，不适合用作组培试验。无性繁殖苗枝条褐化率和污染率也较高，也不适合组培试验。

表3 不同外植体的组培效果Tab.3 Effect of tissue culture in different explants

注：试验采用MS培养基(2.0mg/L 6-BA)。

种子、半年生枝条和1年生枝条由于较为幼嫩，全能性较高，较容易分化，且含病菌少，不易被污染，所以成苗率高。而母竹枝条已经多次分化，老年成分较高，继代培养难以继续分化。无性繁殖苗的根系通常不够发达，抗逆性较差，培养过程中容易被污染。

4.4 不同营养元素对黄化苗外植体的处理效果

培养过程中出现了黄化苗，将刚刚黄化的外植体消毒后放入含有不同营养元素的培养基中，观察30 d，其结果见表4。

表4 不同营养元素对黄化苗外植体的处理效果Tab.4 Effect of different nutrient element on etiolated seedling explants

表4中的数据显示，2.3 g /L的KNO3对黄化苗的处理效果最好，还绿率与成活率都达到最高。NH4NO3在浓度为1.9 g/L时，还绿率和成活率达51.3%和45.2%。所以，NH4NO3对于黄化苗的处理效果也较显著，可以采用。

植物中叶绿素含量减少，类胡萝卜素增加，使植物呈现出黄色的现象叫做黄化。培养过程中，由于培养基中含铁量不足，营养耗尽与分布不均匀等原因使得组培苗发生黄化。K元素能够促进植物生长健壮，保障各种代谢活动的顺利进行。N元素是组成植物体内叶绿素的主要成分，使叶生长茂盛，颜色浓绿。所以，KNO3处理下的黄化苗还绿率较高，效果显著。

4.5 不同土壤基质对组培苗的影响

组培苗经过炼苗等处理后，移入到温室大棚中，在不同的土壤基质上种植2个月,结果见表5。

表5 不同土壤基质对组培苗的作用效果Tab.5 Effect of different soil substrates on seedling

注：移栽苗为种子培养分化成的苗。

表5显示不同土壤基质对组培效果的影响，数据显示,基质为泥炭+红土+珍珠岩的移栽苗生长状况最好，成活率最高。珍珠岩基质组培苗的成活率最低。而单有泥炭土，成活率也较高，株高也与混合土的差不多。所以，在有条件的情况下可选择泥炭+红土+珍珠岩的混合土，也可以选择泥炭土。

5 结论

1)MS培养基中添加2.1 mg/L的6-BA，发芽率较高，达66.7%。

2)6-BA处理的种子发芽率最高，发芽时间也最短，不易产生病菌，苗长势最好。其次是GA3和NAA。

3)成苗率较高的3个外植体依次为半年生播种苗枝条、1年生播种苗枝条和种子。半年生播种苗褐化率和污染率相对较低，最适合作为组培材料。

4)KNO3在浓度为2.3 g/L时，还绿率和成活率达64.2%和57.3%，对于黄化苗的处理效果较显著，适合采用。

5)基质为泥炭+红土+珍珠岩的移栽苗生长状况最好，成活率最高。泥炭土成活率也较高，株高也与混合土的差不多。

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Culture Technology ofCephalostachyumpergracile

SHAN Yan

(Haiyuan College, Kunming Medical University, Kunming 651700, China )

In this paper, the effects of different concentrations of 6-BA and hormones, different explants, different elements and different soil matrixes on the tissue culture experiment were studied. The test results show that 2.1mg/L 6-BA has the highest germination rate; fragrant glutinous bamboo explants was the most suitable for the half year seedlings of branches; the effect of KH2PO4treatment on etiolated seedlings was significantly, suitable soil matrix for transplanting was mixed peat+perlite+clay.

Cephalostachyumpergracile; tissue culture; explants; etiolated seedlings; tissue culture seedlings; seed germination rate; soil matrix

10.3969/j.issn.1671-3168.2017.02.017

2017-02-05.

意大利ONLYMOSO公司(2015002)；云南珍竹农业科技有限公司(2015003)资助项目.

单 妍(1981-)，女，硕士研究生，讲师.研究方向为生物工程.Email:41513075@qq.com

S795；S723.133

A

1671-3168(2017)02-0071-05