三七总皂苷对糖尿病大鼠视网膜病变内皮素-1表达的影响

姚 青，周 月，芦晓红，燕晓雯，马晓东

·论 著·

三七总皂苷对糖尿病大鼠视网膜病变内皮素-1表达的影响

姚 青1，周 月1，芦晓红1，燕晓雯1，马晓东2

目的 探讨三七总皂苷对糖尿病大鼠视网膜病变血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和内皮素-1(ET-1)的影响。方法 采用链脲佐菌素(65 mg/kg)腹腔注射的方法建立大鼠模型，选取50只SD大鼠，将其随机分为5组：正常对照组，糖尿病模型组，三七总皂苷高剂量组(150 mg/kg)，三七总皂苷低剂量组(50 mg/kg)以及导升明组(167 mg/kg)。灌胃给药20周后处死大鼠，取大鼠血清检测AngⅡ和ET-1的含量，摘取眼球，剥离大鼠眼球的视网膜组织，采用免疫组织化学法及荧光定量PCR法检测大鼠视网膜组织中ET-1蛋白及mRNA的表达水平。结果 与正常对照组相比，糖尿病大鼠血清中AngⅡ和ET-1的含量明显增加(P<0.05)，三七总皂苷组中的大鼠血清AngⅡ和ET-1的含量[(336.9±85.9)ng/L，(59.8±8.4)ng/L)]明显低于糖尿病模型组[(557.9±86.2)ng/L，(89.8±7.2)ng/L,P<0.05)]。同时，糖尿病大鼠视网膜组织中ET-1蛋白及mRNA的表达增加，而三七总皂苷组和导升明组大鼠视网膜组织中ET-1的表达明显低于糖尿病模型组大鼠(P<0.05)。结论 三七总皂苷可能通过降低大鼠血清中AngⅡ和ET-1以及糖尿病大鼠视网膜组织中ET-1蛋白与mRNA的表达水平，从而延缓糖尿病大鼠视网膜病变的发生和发展。

三七总皂苷；糖尿病视网膜病变；内皮素-1；血管紧张素Ⅱ

糖尿病患者内分泌代谢紊乱，增高的血糖会导致患者全身微循环系统处于缺氧状态，而长期的缺血缺氧状态将会造成血管内皮尤其是微血管内皮细胞的损伤。正常的内皮细胞通过感受机械及化学刺激来维持血管收缩与舒张之间的动态平衡，而糖尿病患者血管内皮细胞损伤，致使某些血管活性物质表达异常，导致血管收缩及舒张功能失调，最终可能造成视网膜微血管血流量的降低，同时血管的血流速度下降，从而造成眼部组织灌流减少，加重糖尿病视网膜病变的发生发展[1-3]。内皮源性收缩因子(EDCFs)中的内皮素(Endothelin vessels-1，ET-1)是血管内皮细胞产生，具有强烈缩血管效应的多肽[4]。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是由AngⅠ经血管紧张素转化酶水解产生，能够促进ET-1基因表达、合成和分泌的强效刺激因子[5]。AngⅡ和ET-1均是能够影响视网膜血流的血管活性物质。三七总皂苷是三七的主要活性成分，研究表明其能降低机体的耗氧量，提高机体对缺氧的耐受力，有效改善微循环，增加血流量，扩张痉挛血管，还有抗血栓和抗凝血作用。目前，临床主要用于脑血管后遗症、视网膜中央静脉阻塞等疾病的治疗[6]。前期研究已经证实，三七总皂苷可以明显改善糖尿病大鼠视网膜的功能[7]。本研究旨在探讨三七总皂苷对糖尿病大鼠视网膜病变早期干预，观察三七总皂苷对糖尿病大鼠血清AngⅡ、ET-1和视网膜组织中ET-1蛋白和mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物：选择健康雄性Sprague Dawley大鼠(SPF级)50只，体重(250±20)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供[动物合格证号NXSY(宁)2011-0001]。所有大鼠均饲以常规动物饲料和水，在宁夏医科大学实验动物中心SPF实验室饲养。

1.2 药物和试剂：三七总皂苷(血栓通胶囊，黑龙江省珍宝岛制药有限公司)；链脲佐菌素(Sigma公司，美国)；导升明(西安利君制药公司)；ET-1和AngⅡ测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；ET-1抗体(Proteintech公司)；PCR引物(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成)；qRT-PCR试剂盒(Thermo公司)；逆转录酶和Taq 酶(Fermentens公司)；Tizol试剂(Invitrogen公司)。

1.3 仪器：荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)；Image Lab凝胶成像系统(BIORAD，美国)；FreeStyle型培利舒坦血糖仪(雅培公司，美国)；酶标仪(BIORAD，美国)。

1.4 糖尿病大鼠模型的建立：将SD大鼠禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ(按照65 mg/kg体重的剂量)诱导糖尿病大鼠模型。正常对照组注射同等量的溶剂。1周后，将大鼠禁食6 h，从尾静脉采血以检测血糖，将血糖≥16.7 mmol/L者作为糖尿病大鼠模型。

1.5 方法：选取糖尿病模型SD大鼠40只，随机分为4组，分别为糖尿病模型组、三七总皂苷高剂量组(150 mg/kg)、三七总皂苷低剂量组(50 mg/kg)和导升明组(167 mg/kg)，另外选取大鼠10只设为正常对照组。采用灌胃给药，每天1次，共20周，每4周检测血糖1次。饲养期间大鼠自由饮水，颗粒饲料喂养。

1.6 检测指标

1.6.1 大鼠血清AngⅡ和ET-1的检测：腹腔注射2%戊巴比妥钠使大鼠麻醉后，腹主动脉取血，采用酶联免疫吸附法检测血清中ET-1、AngⅡ含量(按试剂盒说明书进行操作)。

1.6.2 视网膜切片标本免疫组织化学染色：将处死后的大鼠右眼用4%多聚甲醛溶液固定，采用LSAB法，脱水石蜡包埋，切片脱蜡，梯度酒精水化，3% H2O2氧化15 min，流水漂洗5 min，滴加兔抗大鼠ET-1多抗1∶100。湿盒孵育24 h后，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光学显微镜下观察、拍照，Image-Pro-Plus 6.0图像分析软件进行半定量分析。

1.6.3 荧光定量PCR反应：Trizol一步法提取总RNA。反转录反应体系:总RNA 3 μg,OligodT 1 μl,dNTP 1 μl,5×Buffer 4 μl,逆转录酶0.5 μl,加无菌水至体系20 μl。引物序列：β-actin 上游5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3’，下游5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3’；ET-1上游5’TTCCCGTGATCTTCTCTCTGCT3’，下游5’TCTGCTTGGCAGAAATTCCA3’。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环。得到Ct值，通过β-actin校正，得到每份样品中ET-1的相对表达量，即Quantity(ET-1/β-actin)。

2 结果

2.1 5组大鼠给药前后的血糖水平：糖尿病大鼠各剂量组的血糖较正常对照组明显升高(P<0.05)，但各剂量组的血糖水平在给药前后差异无统计学意义(P>0.05)。同时，三七总皂苷组和导升明组大鼠血糖水平与糖尿病大鼠模型组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血糖的比较

2.2 5组大鼠血清AngⅡ和ET-1含量的比较:糖尿病模型组大鼠血清AngⅡ和ET-1水平显著升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(t=19.376,P<0.05)。三七总皂苷各剂量组和导升明组糖尿病大鼠血清Ang Ⅱ与ET-1水平较糖尿病模型组降低，差异有统计学意义(t=3.925,P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清Ang Ⅱ和ET-1的比较

注：#与正常对照组比较，P<0.05；*与模型组比较，P<0.05。

2.3 5组大鼠视网膜组织ET-1蛋白及mRNA表达的比较：糖尿病模型组大鼠视网膜组织中ET-1的表达，明显高于正常大鼠组(t=5.978,P<0.05)；三七总皂苷组及导升明组大鼠视网膜组织中ET-1的表达明显低于模型组(t=7.453,P<0.05)；糖尿病大鼠模型组视网膜组织中ET-1mRNA的表达也明显高于正常组(t=4.675,P<0.05)；三七总皂苷组及导升明组大鼠视网膜组织中ET-1mRNA值与模型组相比均有下降(t=3.908,P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠视网膜ET-1表达累积吸光度(IOD)及ET-1mRNA值

注：#与正常对照组比较，P<0.05；*与模型组比较，P<0.05。

3 讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见和严重的并发症之一，它能够引起成年人低视力、视物模糊，甚至视力丧失，从而严重影响患者的生活质量。研究资料表明，具有10年病史的糖尿病患者中视网膜病变的发病率为50%，超过20年病史的糖尿病患者，视网膜病变的发病率接近100%。高血糖已经被证实是糖尿病视网膜病变发展的主要致病因素。研究表明，增高的血糖通过损害血管内皮细胞和线粒体，造成视网膜缺血缺氧，进而导致患者出现微动脉瘤、视网膜出血、视网膜水肿及新生血管形成，甚至视网膜脱离等严重后果。

AngⅡ是由AngⅠ经血管紧张素转化酶水解产生的，能够与血管平滑肌上的AngⅡ受体结合，促进全身微动脉收缩[8-10]。研究表明，在糖尿病高血糖的刺激下，患者AngⅠ和AngⅡ均明显升高。AngⅡ是ET-1表达、合成和分泌的强效刺激因子。而ET-1是内皮细胞和心脏产生，具有强烈缩血管和促进细胞生长增殖作用的血管活性多肽，它是由21个氨基酸残基组成，分子量为2 492 kD。人体有3种结构功能相似的ET，分别称为ET-1、ET-2与ET-3，其中以ET-1是目前已知作用最强、持续时间最长的缩血管肽[11-13]。糖尿病患者血糖过高会导致血流速度减慢，造成组织缺血缺氧，从而导致患者全身血管内皮细胞损伤，血小板易聚集黏附在损伤的血管内皮上，刺激损伤的内皮血管细胞中ET-1的代偿性分泌[14]。研究表明，糖尿病视网膜疾病患者血清ET-1水平明显升高，而经控制血糖水平后ET-1的水平又呈下降趋势，提示正常生理情况下视网膜循环主要通过旁分泌和(或)胞内分泌来调节血管张力和器官血流量，当糖尿病患者血糖升高时会刺激ET-1的释放，高浓度ET-1通过强烈收缩血管、促进细胞增殖，促使视网膜微循环发生障碍[15-16]。因此，测定血清ET-1含量可准确反映体内血管内皮细胞损伤程度。

三七总皂苷是三七的主要有效成分之一，具有活血化瘀、通脉活络、抑制血小板聚集和增加心脑血流量的功效。现代研究证明三七总皂苷能够显著降低高血压患者的MDA，明显升高SOD，增加红细胞变形能力，降低红细胞的聚集性。动物实验显示，三七总皂苷可使大鼠实验性室性早搏明显减少，心率失常持续时间明显缩短，明显降低大鼠心梗后再灌注时心律失常的发生率。另外，三七总皂苷还能够显著抑制血小板聚集和黏附，改善微循环，具有抗血栓和抗凝血作用。课题组前期研究已经证实三七总皂苷可以明显改善糖尿病大鼠视网膜电生理，增加视网膜毛细血管的血流速度，显示了良好的药效。

本研究利用STZ构建糖尿病视网膜病变大鼠模型，灌胃给予不同剂量的三七总皂苷，观察大鼠视网膜组织AngⅡ和ET-1的表达情况。结果显示，糖尿病大鼠血糖较正常对照组明显升高，三七总皂苷各剂量组的血糖水平较给药前下降。但是三七总皂苷组和导升明组大鼠血糖水平与糖尿病大鼠模型组无显著性差异，说明三七总皂苷对血糖水平的影响不明显。同时，与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血清AngⅡ和ET-1水平均显著升高，说明糖尿病大鼠血管内皮功能受到损伤，而血管内皮受损是导致糖尿病微血管病变的主要机制。给予不同剂量的三七总皂苷干预治疗后,三七总皂苷组糖尿病大鼠血清AngⅡ和ET-1的含量较模型组均有不同程度的降低，尤其是三七总皂苷高剂量组改善最为明显；而导升明组也可以降低大鼠血清AngⅡ和ET-1的含量，但是与三七总皂苷组无明显差异。同时，免疫组织化学和荧光定量PCR的检测都证实糖尿病大鼠视网膜组织ET-1蛋白及mRNA的表达与正常对照组相比显著升高。在三七总皂苷的干预下，大鼠视网膜组织ET-1蛋白及mRNA的表达较模型组大鼠显著下降，说明三七总皂苷具有改善糖尿病大鼠视网膜血管内皮功能、调节血管收缩功能的作用。因此，对AngⅡ和ET-1含量的有效调节可能是三七总皂苷改善糖尿病视网膜病变的药效机制之一。

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Effect of panax notoginseng saponins on endothelin-1 in retina of diabetic rats

YAOQing1，ZHOUYue1，LUXiaohong1，YANXiaowen1，MAXiaodong2.
1.NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China;2.NingxiaPeople'sHospital，Yinchuan750002，ChinaCorrespondingauthor:MAXiaodong，Email:mxd119@163.com

Objective To explore the effect of panax notoginseng saponins on the expression of Endothelin-1 and AngⅡin retina of diabetic rats.Methods Streptozotocin (STZ，65 mg/kg) was injected intraperitoneal to establish the diabetic model and the diabetic rats were randomly divided into 5 groups:normal group，diabetic model group，panax notoginseng saponins groups (50 mg/kg，150 mg/kg) and doxium group (167 mg/kg).The normal group and the model group were given water and the other rats were medicated with intragastric administration for 20 weeks，then killed all rats.The serum of AngⅡ and ET-1 levels were measured.The protein expression of ET-1 in retina was detected by using immunological histochemistry assay.The expression of ET-1mRNA in retina of rat was detected by real-time quantitative PCR.Results The level of AngⅡ and ET-1 in serum of model group were(557.9±86.2)ng/L and(89.8±7.2)ng/L，which were higher than those in control group.The protein expression of ET-1 and the expression of ET-1mRNA in model group were higher than those in control group (P<0.05).The level of ET-1 in serum of panax notoginseng saponins groups were lower than those in model group (P<0.05).Compared with the model group，the expression of ET-1 in panax notoginseng saponins groups decreased and the expression of ET-1mRNA were decreased than those in model group (P<0.05).Conclusion Panax notoginseng saponins can decrease the expression of ET-1 in retina of diabetic rats and improve the diabetic retinopathy.

Panaxnotoginsengsaponins；Diabeticretinopathy；Endothelin-1；AngiotensinⅡ

宁夏自然科学基金资助项目(NZ13279)

1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004 2.宁夏人民医院，宁夏 银川 750002

姚青(1975-)，女，副教授，博士，主要从事糖尿病眼病的分子机制及药物治疗研究方向。

马晓东，Email:mxd119@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170508.1147.002.html

10.13621/j.1001-5949.2017.05.0388

R285

A

2016-10-13 [责任编辑]李 洁