壮药香茅草HPLC指纹图谱研究

叶绘晟，龚志强，梁 芳，谢丽莎

(广西中医药大学赛恩斯新医药学院，中国 南宁 530222)

壮药香茅草HPLC指纹图谱研究

叶绘晟，龚志强，梁 芳，谢丽莎

(广西中医药大学赛恩斯新医药学院，中国 南宁 530222)

采用Xtimate C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱，乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速0.8 mL·min-1，检测波长226 nm，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004 A 版)计算相似度，建立香茅草指纹图谱共有模式，标定了13个共有峰，用指纹图谱相似度评价系统对样品进行模式辨识，12批样品指纹图谱与建立的对照指纹图谱之间的相似度均在 0.9以上.因此，指纹图谱是一种有效的评价方法，可为香茅草的质量控制提供依据.

香茅草；HPLC；指纹图谱；模式识别

香茅草为壮族、瑶族等少数民族地区习用药材，壮药名为棵查哈,性温，味辛、甘，具有散寒解表、祛风通络、温中止痛之功效，用于外感风寒、风寒湿痹、脘腹冷痛、跌打损伤、寒湿泄泻[1].香茅草原产东南亚等周边地区[2-3]，我国广西、贵州、云南、广东、台湾等少数民族居住地均有生长，其中台湾香茅草产业发展得较早[4].香茅草具有抗菌、抗氧化、止痛、降压、免疫调节、肿瘤抑制作用[5-8].香茅草挥发油主要化学成分为橙花醛、柠檬醛和月桂烯，目前研究香茅草的药理作用、化学成分和提取方法文献较多[9-11]，但指纹图谱方面未见报道.本文采用HPLC进行香茅草的指纹图谱研究，为科学评价和有效控制香茅草药材的质量提供实验依据.

1 仪器和试药

Agilent 1200高效液相色谱仪和DAD检测器(美国安捷伦科技有限公司)，XS105DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，AFZ-1001-U艾科浦超纯水系统(重庆颐洋企业发展有限公司)，LG16-W台式高速离心机(北京京立离心机有限公司).乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯.柠檬醛对照品由Heidrich博士提供，含量为99.0%(批号：90921).香茅草药材购自广西各地(表1)，经广西中医药大学赛恩斯新医药学院生药教研室苑敏鉴定为禾本科植物香茅Cymbopogoncitratus(DC.)Stapf全草.

表1 香茅草药材信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相:乙腈-0.1%磷酸洗脱系统，梯度洗脱程序见表2，流速：0.8 mL/min，检测波长：226 nm，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，理论塔板数按橙花醛峰计算应不低于5 000.

表2 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取柠檬醛对照品约5 mg，精密称量，置于25 mL容量瓶中，用适量的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得.

2.2.2 供试品溶液的制备 取香茅草药材粉末约2 g，精密称量，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，静置30 min，超声提取30 min，过滤，滤液60 ℃水浴蒸干，用适量的甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，进离心机离心(10 000 r/min)10 min，取上清液，再用0.45μm 微孔滤膜过滤,即得.

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一批香茅草药材粉末，按2.2.2项下制备方法制成供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图.结果各共有峰的相对保留时间RSD为0.02%～0.71%，相对峰面积RSD为0.40%～2.99%，符合指纹图谱分析要求.

2.3.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液.按2.1项下的色谱条件，分别在0,4,8,12,16,20,24 h进样.结果各共有峰相对保留时间RSD为0.02%～0.27%，相对峰面积RSD为1.87%～2.98%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定.

2.3.3 重复性试验 取同一份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定.结果6份香茅草样品中各共有峰的相对保留时间RSD为0.05%～0.84%，相对峰面积RSD为1.56%～2.82%, 符合指纹图谱分析要求.

2.4 指纹图谱的建立及共有峰的确定

取12批香茅草药材粉末，按2.2.2项制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件依次进样分析，得到12批香茅草药材 HPLC色谱叠加图，见图1.采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对12批香茅草药材指纹图谱的相关参数进行自动匹配，共标定出13个共有指纹峰，见表3，共有指纹峰的峰面积占总峰面积的90%以上.相似度软件设置，选择S1药材的图谱为参照图谱，以平均数法作为生成对照指纹图谱的方法，设定时间窗宽度为0.4 min，软件自动匹配图谱，系统依据香茅草药材的共有模式生成对照指纹图谱，见图2.

图1 12批香茅草药材HPLC色谱叠加图Fig.1 HPLC fingerprint of reference 12 batches of Cymbopogon citratus

图2 香茅草对照指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint of Cymbopogon citratus

表3 共有峰分析结果

2.5 指纹图谱相似度评价

本实验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》指纹图谱相似度软件计算香茅草药材指纹图谱相似度.将12批次香茅草药材样品实验数据导入，以平均数法作为生成对照指纹图谱的方法，时间窗为0.4 min，选择对照指纹图谱峰的10号峰进行多点校正，系统自动匹配，计算香茅草药材高效液相指纹图谱相似度，结果显示，S1～S12的相似度分别为0.936，0.925，0.990，0.982，0.969，0.967，0.943，0.964，0.973，0.956，0.905，0.983，均大于0.9，表明相似度良好.

3 小结与讨论

(1)通过实验获得在210,226和256 nm波长处的高效液相色图谱,并用二极管阵列检测器获得三维全波长色图谱进行分析.实验表明香茅草样品在210 nm 波长下色谱峰信息一般，峰型不高，且210 nm波长为近紫外吸收；256 nm波长下的色谱峰信息信号较少，且峰高不高；226 nm波长下的指纹图谱基线基本上保持平稳，而且色谱峰的信号较多.为了保证样品在色谱图中各化学信息完整可靠，本实验高效液相的检测波长选择为226 nm.

(2)通过实验分别将甲醇-水系统、乙腈-水系统、乙腈-0.1%冰醋酸和乙腈-0.1%磷酸4个流动相系统对香茅草药材高效液相色谱图进行考察.实验结果表明以乙腈-0.1%磷酸流动相系统的色谱图各峰形好，出峰时间适中，各峰之间分离度也达到要求.空白试验表明所选用流动相对样品分析无杂质干扰.实验进行了延长冲洗试验并记录了150 min色谱图，发现70 min后无色谱峰出现，故确定采集时间为70 min.

(3)本次实验分别比较了甲醇、乙醇、水、石油醚和乙酸乙酯5种提取溶剂，考察了回流提取、超声提取和冷浸提取3种样品提取方法.超声辅助提取与传统醇提法相比，可以缩短提取时间，节省溶剂，提高有效成分的提取效率，简化提取操作步骤[12]，实验结果表明甲醇超声提取所得到的色谱图中的色谱峰数多，且分离效果好，故选定甲醇超声提取.同时分别比较了超声提取时间为15,30,45 min情况下所得的指纹图谱，发现超声提取30 min时可提取充分，实验时间适宜，综合考虑，故确定超声提取时间为30 min.

中药的质量不仅与中药种植有关，更关系到中药饮片的加工与贮藏[13]，以某单一的有效化学成分来控制中药质量已经不能适应现代中药的发展要求，目前指纹图谱的实验研究已成为现代中药研究常用的一种方法[14]，可以在不清楚全部化学成分的情况下控制中药药材中的内在质量.此次香茅草药材指纹图谱测定方法简便、快速而且准确、可靠，可为该药材质量控制研究及应用提供实验依据.

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(编辑 WJ)

HPLC Fingerprints of Zhuang MedicineCymbopogonCitratus

YEHui-sheng,GONGZhi-qiang*,LIANGFang,XIELi-sha
(Faculty of Chinese Medical Science, Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530222, China)

The Xtimate C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) chromatography column was used with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution in the gradient elution mode. The flow rate was 0.8 mL·min-1and the detection wavelength was 226 nm. The similarity assay for the fingerprints ofCymbopogoncitratuswas carried out to evaluate their quality with the Chinese material medica fingerprint similarity evaluation system (2004 A edition). The common mode of HPLC fingerprints forCymbopogoncitratuswas set up. There were 13 common peaks in the fingerprints, and the similarity degrees of 12 batches of samples were above 0.9. Hence, the established method is effecient for the quality control of the Zhuang medicineCymbopogoncitratus.

Cymbopogoncitratus; HPLC; chromatographic fingerprint; pattern recognition

2016-08-31

广西教育厅科研课题一般资助项目(YB2014616;2013LX064)

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.03.009

R285.5

A

1000-2537(2017)03-0049-04

*通讯作者,E-mail：gong150645259@126.com