调节因子X5及其复合物的研究进展*

赵杨静，谢兴旺，王荟，闫美娜，邵启祥

(1.江苏大学医学院，江苏镇江 212013；2.北京大学人民医院北京大学肝病研究所，丙型肝炎及肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京 100044)

·综述·

调节因子X5及其复合物的研究进展*

赵杨静1,2，谢兴旺2，王荟1，闫美娜1，邵启祥1

(1.江苏大学医学院，江苏镇江 212013；2.北京大学人民医院北京大学肝病研究所，丙型肝炎及肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京 100044)

调节因子X5(regulatory factor X5，RFX5)是在人体广泛表达的DNA结合蛋白，它通过结合RFXB和RFXAP形成RFX复合物，主要功能是转录调控主要组织相容性复合体MHCⅡ类基因。研究发现，RFX5还具有转录调控非MHC类靶基因的功能，尤其是与肿瘤相关的研究提示，RFX5可能在免疫系统和肿瘤进程中发挥重要的跨界分子作用。该文综述了RFX5及其组成RFX复合物的生物学特性，以及在裸淋巴细胞综合征、动脉粥样硬化和肿瘤等疾病中RFX5转录调控靶基因的研究进展。

调节因子X5；RFX复合物；转录调控；靶基因；肿瘤

调节因子X5(regulatory factor X5, RFX5)是Steimle等[1]在1995年首次从Ⅱ型C群裸淋巴综合症(bare lymphocyte syndrome type Ⅱ complementation group C，BLS)患者来源的细胞系(SJO)cDNA表达文库中分离得到，是RFX基因家族成员之一。RFX复合物最初是从MHCⅡ类分子阳性的B细胞核提取物中被识别的异源三聚体，由RFX5、含锚蛋白重复序列的RFX(RFX containing ankyrin repeats，RFXB，亦称RFXANK)和RFX相关蛋白(RFX-associated protein，RFXAP)3个亚基组成，分子量(Mr)分别为75、33和41，其中具有DNA结合和核转运能力的RFX5在三聚体中发挥最主要的作用。RFX蛋白以结合主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类基因启动子区高度保守的顺式作用元件X盒而得名，含76个超保守氨基酸序列的DNA结合域(DNA binding domain，DBD)，是一类具有特殊功能和作用模式的DNA结合蛋白[2-3]。近年来的研究发现，RFX5还具有转录调控非MHC类靶基因的功能。本文旨在对RFX5及其参与形成RFX复合物的生物学特性，以及RFX5转录调控靶基因及相关疾病等方面的研究进展作一综述。

1 RFX5和RFX复合物的生物学特性

1.1 经典作用模式 RFX复合物可促进其他转录因子结合MHCⅡ类基因上游调节区的保守序列(conserved upstream sequences，CUS)，并增强结合的特异性和亲和力，在MHCⅡ类基因转录过程发挥关键作用。有学者认为RFX5可结合预先装配的RFXB和RFXAP，形成RFX复合物结合S、X1盒；也有学者认为携有核定位信号(nuclear localization signals，NLS)的RFX5和RFXAP在胞浆先结合并转运至胞核，再与核定位能力弱的RFXB结合[3]。RFX复合物招募X2BP(X2 box binding proteins)、NF-Y(nuclear factor Y)形成MHC Ⅱ增强体(MHC Ⅱ enhanceosome)，提供了一个供CⅡTA(class Ⅱ transactivator)结合的平台，进而由CⅡTA募集其他通用调节因子形成转录体启动转录和延伸，最终促进MHCⅡ类分子表达(图1)[4-6]。还有研究表明，RFX复合物以类似机制参与MHC Ⅰ类和MHC附属基因(如β2微球基因)的转录调控[7]。

图1 MHCⅡ类基因的转录调控示意图

1.2 基本蛋白质结构与功能 RFX复合物的3个亚基蛋白结构各异且存在交互作用，是RFX复合物在MHCⅡ增强体中发挥与DNA结合、蛋白质间相互作用和反式激活功能的必要结构基础[8]。RFX5蛋白由616个氨基酸构成，分为5个功能区：寡聚化结构域(oligomerization domain，OD)、DNA结合域(DBD)、螺旋形结构域(helical domain，HD)、富含脯氨酸的区域(proline-rich region，P-rich)和反式激活区域(transactivation domain，AD)。见图2。所有功能域发挥各自功能，促进RFX复合物的募集及与其他MHCⅡ基因调节因子的相互作用。OD功能域能调节RFX复合物的二聚化并结合其他RFX复合物成员，利用化学筛选点突变方法，发现OD区含有1个亮氨酸富集二聚基序(62-LYLYLQL-68)，其突变使得RFX5的DNA-蛋白质结合和反式激活功能丧失[9]，L66A点突变会阻断了RFX5二聚体和DNA环(DNA loop)的形成[10]。DBD是RFX复合物最主要的DNA结合域，包括3个α螺旋(H)、β链(S)和连接线(L)，连接顺序为H1-S1-H2-L1-H3-L2-S2-W1-S3，L3连接S2和S3形成疏水核侧翼W1，W1和H3分别与对称回文结构X1盒的主沟和小沟作用。DBD中高度保守的9个残基直接或由水介导接触DNA序列，从而实现DNA-蛋白质相互作用，与X1盒的5′端和中心序列结合的区域[11]。有研究推测在BLS患者来源的Ker细胞中DBD功能域的R149Q点突变会导致BLS第5个互补群[12]。HD、P-rich和AD功能域参与RFX5和MHCⅡ增强子其他组分的相互作用，协助MHCⅡ基因的转录[8,10]。AD功能域存在一种小型的DNA结合蛋白基序——AT-hook，其突变会明显抑制人HLA-DQ基因表达[13]；此外，还有1个非典型双NLS，其可协助RFX5蛋白高效转运入核发挥作用[3]。RFXB蛋白是由260个氨基酸组成的蛋白质，N端含有与短寿命蛋白相关的PEST(proline/glutamic acid/serine/threonine)结构域同源的功能未知区域，但缺失PEST的保守末端序列，所以无短寿命蛋白的特性。RFXB蛋白最小功能区是C端含有的4个锚蛋白重复序列(ankyrin repeats)，构成β-发夹环(β-hairpin loops)和内螺旋(inner helices)使其结合RFX5和RFXAP。PEST区和锚蛋白之间有一段区域(第69～123个氨基酸)能够交联到X1盒3′端[8]。见图2。RFXAP是由272个氨基酸组成的蛋白质，最小功能区是C端第184～266个氨基酸，包含富含谷氨酰胺功能域(Q-rich region)，参与结合RFX5和RFXB，且RFXAP广泛结合于X1盒全长[8,14]。

注：功能域名称在条框中标出，箭头和括号表示功能和相互作用。

图2 RFX复合物蛋白功能域示意图

1.3 复合物模型 通过分析RFX复合物低聚态和组分比例发现，RFXB和RFXAP是单体，RFX5通过OD功能域形成二聚体。RFX复合物化学计算比例为RFX5·RFXAP·RFXB(2∶1∶1)，或通过RFX5的OD功能域再结合1个RFX5二聚体(4∶1∶1)。RFX复合物有3种DNA结合模型[10]。模型1：2个RFX复合物通过RFX5的功能域二聚化交互结合到S和X1盒；模型2：RFX复合物结合X1盒，RFX5结合S盒，因此S盒序列突变不影响RFX复合物结合MHCⅡ启动子区；模型3：也称为DNA环模型，MHCⅡ基因的转录调控可以受远端X1盒的调控，2个RFX复合物分别结合近端和远端的X1盒形成DNA环，DNA环能募集MHCⅡ基因的远端顺式作用元件，直接影响附近MHCⅡ基因染色质结构和表达[15]。见图3。

图3 RFX复合物DNA结合模型示意图

2 RFX5与疾病

2.1 RFX5与MHCⅡ类分子缺陷症 MHCⅡ类分子表达调节严格依赖于RFX复合物和CⅡTA，任一调控基因突变产生截短蛋白或无效蛋白，使MHCⅡ类分子表达缺陷和CD4+T细胞活化障碍，不能有效地产生免疫应答，导致MHCⅡ类分子缺陷症(也称BLS)[16]。BLS是一种罕见的原发性常染色体隐性免疫缺陷病，患者典型临床表现为严重的复发性感染，包括胃肠道和泌尿道功能异常，其主要诊断方法是检测各种类型的细胞表面MHCⅡ分子的表达。BLS是一种单基因病，即单个缺陷基因可导致所有临床表现。根据MHCⅡ调节基因突变体不同，BLS可分为A、B、C和D 4个互补群，对应的突变基因分别是CⅡTA、RFXB、RFX5和RFXAP。目前RFX5、RFXAP和RFXB基因已分别被鉴定出6个、3个和9个导致MHCⅡ类分子表达缺陷的突变位点，其中突变频率最高的是RFXB基因5号和6号外显子之间26个碱基缺失(752delG-25)。因此，针对RFX复合物和CⅡTA等遗传分子和淋巴细胞标志物的检测方法将有助于BLS疾病的检出和诊断。目前BLS患者首选治疗方案是同种异体造血干细胞移植，理论上将外源野生型RFX基因导入对应BLS患者造血干细胞可作为BLS基因治疗的策略[14,17-19]。

2.2 RFX5与动脉粥样硬化 MHCⅡ类分子只表达于特定抗原提呈细胞表面，而RFX5在人体各组织中广泛表达，甚至在MHCⅡ类分子阴性的细胞中也检测到RFX5表达[1,18]，理论上一个转录因子可以同时调控多个靶基因[20]，因此RFX5还有可能具有转录调控非MHC类靶基因的功能。

Ⅰ型胶原基因是第1个被发现的RFX5非MHC类靶基因，胶原基因转录起始位点有与MHC基因X盒的同源序列。人纤维细胞中RFX蛋白有2条通路抑制胶原基因表达：RFX5通过干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)和RFX1经甲基化方式抑制Ⅰ型胶原基因转录和表达。炎症过程中，血管平滑肌细胞可分泌IFN-γ促进人纤维细胞中RFX复合物表达和核转运，参与形成RFX5/HDAC2/Sin3B/G9a复合物，通过类似调控MHCⅡ类基因的动力学，结合胶原基因COL1A2的转录起始位点，抑制Ⅰ型胶原基因转录，从而抑制瘢痕和纤维化，是动脉粥样硬化斑块失稳和破裂的关键环节。因此，靶向RFX5复合物是潜在的抗动脉粥样硬化的治疗方法[21-23]。然而，在平滑肌细胞中，组蛋白脱乙酰酶SIRT1能通过负向调控RFX5活性，拮抗RFX5对COL1A2的抑制作用[24]。

2.3 RFX5与肿瘤 研究显示，RFX5参与错配修复过程，纯化重组的RFX5能在体外实验中激活5′→3′错配剪切修复系统，敲减RFX5后细胞出现微卫星不稳定现象。其机制可能是RFX5作为转录因子调控错配修复因子，或RFX复合物(尤其是RFXB)可参与染色质重塑，有助于错配剪切[25]。

RFX5编码基因位于的染色体1q21区段，在多种癌前和癌变疾病中发生高频率染色体变异，肿瘤细胞此区段RFX5编码基因突变，会导致肿瘤细胞MHCⅡ类分子表达完全缺失，有助于肿瘤细胞逃避免疫监视[26]。在结直肠癌中，MHCⅡ调控基因发生编码微卫星突变，其中RFX5基因突变率最高，因此有学者提出RFX5、RFXB和RFXAP体细胞突变，可能引起高水平微卫星不稳定，最终导致MHCⅡ类分子在肿瘤细胞中的表达缺失，从而有助于肿瘤细胞的免疫逃逸[27-28]。本课题组研究发现RFX5在6种消化系统肿瘤(食管鳞状细胞癌、胃腺癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肝细胞肝癌和胰腺腺癌)组织中mRNA和蛋白质水平均明显高于癌旁组织，且在胃腺癌和肝细胞肝癌中的上调最为明显。RFX5 mRNA水平在384例胃腺癌组织和371例肝细胞肝癌组织中均显著高于其癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。癌症组织芯片结果显示，RFX5蛋白在胃腺癌组织中2例中度表达和3例强阳性，在肝细胞肝癌中3例中度表达和2例强阳性，而在其配对癌旁组织中表达水平均较弱[29]。Zhou等[30]通过分析HBV和HCV相关肝细胞癌样本的表达谱芯片数据，发现RFX5在两种肝癌基因表达失调网络中均发挥重要调节作用，并推测RFX5转录调节功能可能与肝细胞癌变进程相关。最近，本课题组研究结果进一步证实，RFX5在肝细胞肝癌细胞和组织中过度表达，却不能上调MHCⅡ类基因表达，而是通过转录激活肿瘤相关基因TPP1(tripeptidyl peptidaseⅠ)过度表达，其表达水平与肝癌患者预后相关，从而参与促进HCC的发生、发展[31]。Sethi等[32]通过生物信息学分析ENCODE数据库中ChIP-Seq数据，预测在角化细胞中抑癌基因p63能结合在RFX5基因上游的远端调节子，两者相互作用形成转录反馈环并调节p63结合靶点。RFX5 mRNA和蛋白质倾向于表达在p63富集的人表皮细胞，进一步佐证RFX5和p63两者可能在细胞增殖和分化等多种生物进程中存在紧密联系[33]。

3 小结及展望

经典的研究认为RFX复合物通过3个亚基的精密协作，参与MHCⅡ类分子表达调控，发挥调节免疫应答的功能。近年来的研究发现，这种MHCⅡ类基因转录严格依赖的DNA结合蛋白，可能在非MHC类靶基因转录中也发挥重要作用，如在生理状态中具有调控胶原基因和参与DNA错配修复等功能；在肿瘤中RFX基因突变，尤其RFX5基因突变，可能通过改变MHCⅡ类分子表达，促进肿瘤细胞逃避免疫监视，或直接调控其他肿瘤相关基因参与癌变进程。因此，在RFX5及其组成RFX复合物现有的认识基础上，探索其在肿瘤等疾病中转录调控非MHC靶基因的作用和功能有可能成为今后研究的热点。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.10

国家自然科学基金面上项目(81541151，81372221，81671541，81273202)；江苏省临床医学科技专项(BL2013024)。

赵杨静，1990年生，女，博士研究生，研究方向：肿瘤相关基因和肿瘤免疫学。

邵启祥，教授，博士，E-mail:shao_qx@ujs.edu.cn。

Q344+.14

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2017-02-16)