“东一号”麻超氧化物歧化酶含量的影响因素分析

李婷婷，陈冰，2*，吴莹莹，杨立茵，林兆廷，张帮传，陈伟南，陶进转

（1.岭南师范学院化学化工学院，广东 湛江 524048；2.广东高校新材料工程技术开发中心，广东 湛江 524048；3.农业部剑麻及制品质量监督检验测试中心，广东 湛江 524022）

“东一号”麻超氧化物歧化酶含量的影响因素分析

李婷婷1，陈冰1，2*，吴莹莹1，杨立茵1，林兆廷1，张帮传1，陈伟南3，陶进转3

（1.岭南师范学院化学化工学院，广东 湛江 524048；2.广东高校新材料工程技术开发中心，广东 湛江 524048；3.农业部剑麻及制品质量监督检验测试中心，广东 湛江 524022）

通过对“东一号”麻不同种植时间、不同部位和不同生产副产物的超氧化物歧化酶的活力分析，结果表明其存在一定差异。研究结果揭示了“东一号”麻超氧化物歧化酶活力的影响因素，为“东一号”麻的生产和开发利用提供了参考依据。

因素分析；“东一号”麻；超氧化物歧化酶

“东一号”麻（Agave Hybrid No.11648）是龙舌兰科（Agavaceae）龙舌兰属（Agave）中的一个杂交种，是以假菠萝麻（Agave angustifolia Haw.）为母本，蓝剑麻（Agave amaniensis T.at.L.）为父本杂交，经过杂交得到 F1代，再由 F1与蓝剑麻回交而成，是一种多年生热带硬质纤维经济作物［1］。

“东一号”麻是我国引种龙舌兰麻的当家品种，其汁液副产物富含各种生物活性物质，如蛋白质、皂素类物质和糖类，以及超氧化物歧化酶（SOD，［EC.1.15.1.1］）等［2］。

SOD是一类广泛存在于生物体内的重要金属还原酶，也是一类具有催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧气的重要的自由基清除剂，其能使自由基的形成和消除处于平衡，从而抵御超氧阴离子自由基的毒害作用，在抗辐射、抗肿瘤、抗逆境及延缓机体衰老等方面起着重要作用，为医药、食品、保健和日用化工等行业所青睐，而国际生化委员会、美国联邦食品管理局（FDA）则称其为人体垃圾“清道夫”、“抗衰因子”、“美容骄子”。

目前，天然 SOD的主要来源是从动物血液和肝脏中提取，其弊端在于原料局限，尤其是其在使用过程中可能产生交叉感染，因此天然 SOD使用的安全性备受关注，并促使我们从丰富的植物资源中寻求安全的天然 SOD酶源［3，4］。

本研究通过对“东一号”麻不同种植时间、不同部位和不同生产副产物的 SOD进行分析，以期获得生产开发利用的有用参数。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

高速冷冻离心机（Eppendorf AG 22331 Hamburg，德国艾本德有限公司），电脑全自动部分收集器（DBS－上海青浦沪西仪器厂），恒流泵（HL－ZS型，上海青浦沪西仪器厂），层析柱（2.6 cm× 40 cm，上海锦华设备厂），紫外可见光分光光度计（UV－1100型，上海美谱达仪器有限公司）。

1.2 主要试剂

三羟基氨基甲烷（Tris，色谱纯），Sigma公司；二乙氨基乙基纤维素（DEAE），Waterman；葡萄糖凝胶，Sephadex G－75，Pharmacia／上海化学试剂分装厂；考马斯亮蓝 G－250，北京定鼎国生物技术有限责任公司；氯化硝基氮蓝四唑（NBT）、核黄素、牛血清蛋白，国药集团化学试剂有限公司。其余试剂为国产分析纯或生化试剂。所用水均为石英亚沸蒸馏水。

1.3 方法

1.3.1 酶的制备与纯化

称取洗净的“东一号”麻样品 100 g，剪碎，加入 100 mL 0.05 mol／L pH 7.5的 Tris－HCl缓冲液，匀浆 10 min，经 4层 纱布过 滤，再 用上述 缓冲液 分两次 冲洗 滤渣，收集 滤 液，于 常 温 下6000 r／min离心 10 min，收集上清液为粗酶液。取上述粗酶液加入硫酸铵至饱和度 45%，4℃静置2～3 h，离心，收集上清液，继续加入硫酸铵至饱和度 85%，4℃静置过夜。离心，弃去上清液，所得沉淀用 0.003 mol／L pH 7.5的 Tris－HCl缓冲溶液溶解，离心，弃去沉淀，上清液为硫酸铵沉淀溶解液。上述溶解液 经 浓缩 后 上 DEAE纤 维素 柱 （2.6 cm ×60 cm），用 0.005 mol／L Tris－HCl（pH 7.5）缓冲溶液洗脱，收集活性峰管洗脱液。所得洗脱液经离心、浓缩，上 Sephadex柱，用0.003 mol／L pH 7.5的 Tris－HCl缓冲液洗脱，流速 4.4 mL／4 min，可得蛋白吸收峰，收集其酶液，测定其蛋白含量和活力［2］。

麻水经离心、浓缩后分别上 DEAE纤维素柱和 Sephadex柱，收集蛋白吸收峰，测定其蛋白含量和活力。

麻膏加入 0.003mol／L pH 7.5的 Tris－HCl缓冲溶液浸泡过夜，过滤、离心、浓缩后分别上 DEAE纤维素柱和 Sephadex柱，收集蛋白吸收峰，测定其蛋白含量和活力。

1.3.2 活力的测定

以 NBT光还原法测定酶活性。以抑制 NET光还原反应 50%的酶液量作为一个酶活力单位（U）［2，3，5］。

1.3.3 蛋白含量的测定

采用 Braford（考马斯亮蓝 G－250染色）法测定蛋白含量，以牛血清蛋白为标准品制作标准曲线［2，3，6］。

2 结果与讨论

2.1 不同种植时间的影响

“东一号”麻不同种植时间的 SOD活力测定结果如图 1所示。可见，从不同种植时间看，苗麻叶的活力最高，幼麻叶居中，老麻叶最低。因此，从 SOD开发角度看，“东一号”麻种植时间无需太长。

图1 不同种植时间对活力的影响Fig.1 Effects of different planting time on activity

2.2 不同部位的影响

另外，“东一号”麻不同部位的 SOD活力测定结果如图2所示。可见，从不同部位看，活力按苗麻叶、苗麻心、苗麻头顺序由高到低变化，但苗麻叶和苗麻心差异不大。因此，苗麻叶和苗麻心可以共同利用。

图2 不同部位对活力的影响Fig.2 Effects of different parts on activity

2.3 不同副产物的影响

此外，“东一号”麻生产加工的不同副产物的 SOD活力测定结果如图 3所示。可见，从生产加工的不同副产物来看，麻水的活力比较高，而麻膏基本没有活力。所以，综合利用生产加工的副产物麻水中的 SOD是可行的。

图3 不同副产物对活力的影响Fig.3 Effects of different by－ products on activity

3 结论

“东一号”麻作为我国引种龙舌兰麻的当家品种，其汁液等副产物富含各种生物活性物质的综合利用，值得深入研究。从 SOD活性成分利用的角度及不同种植时间结果来看，苗麻叶的活力最高，从 SOD开发角度看，“东一号”麻种植时间无需太长。另外，从不同部位看，苗麻叶和麻苗心的活力均较高，均是“东一号”麻利用为 SOD的主要部位。此外，从生产加工的不同副产物来看，麻水的活力比较高，故以其综合利用 SOD是可行的。

通过对“东一号”麻不同种植时间、不同部位和不同生产副产物的 SOD活力分析，为“东一号”麻的生产开发利用提供了参考依据。

［1］徐凤彩，卢顺舵，廖毅，等.“东一号”剑麻蛋白酶分离纯化及特性研究［J］.华南农业大学学报，1993，14（1）：33－139.

［2］Chen B，Chen L，Gao L J，etal.Purification and partial properties of a superoxide dismutase from Agave Hybrid No.11648［J］. JChin Chem Soc，2012，59（4）：520－524.

［3］杨就锦，陈冰，李嘉亮，等.金边龙舌兰超氧化物岐化酶的提取与特性研究［J］.化学研究与应用，2014，26（4）：497－500.

［4］McCord JM，Fridovich L.Superoxide dismutase：An enzyme function for erythrocuprein（hemocuprein）［J］.JBio Chem，1969，244：6049－6055.

［5］Ries SK.Superoxide dismutases II.Purification and quantitative relationship with water－soluble protein in seedlings［J］.Plant Physiology，1977，59（2）：315－318.

［6］Bradford，M M.A rapid and sensitivemethode for quantitation ofmicrogram quantitesof proiteinsutilizing the principle of protein－dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72，248－254.

The Analysis of Influencing Factors about the Superoxide Dismutase in Agave Hybrid No．11648

LITingting1，CHEN Bing1，2*，WU Yingying1，YANG Liyin1，LIN Zhaoting1，ZHANG Bangchuan1，CHENWeinan3，TAO Jinzhuan3
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Lingnan Normal University，Zhanjiang，Guangdong 524048，China；2.Development Centre for New Materials Engineering＆Technology in Universities of Guangdong，Zhanjiang，Guangdong 524048，China；3.Sisal and Products Quality Inspection and Testing Center of Agricultural Ministry，Zhanjiang，Guangdong 524022，China）

The activity of the superoxide dismutase has been analyzed by studying the planting time，different parts and different by－products in Agave Hybrid No.11648.The result showed that therewere some differences for the superoxide dismutase by the above factors.The results revealed that the factors influencing the activity of the superoxide dismutase in Agave Hybrid No.11648，and which can provide the support for the production and utilization of Agave Hybrid No.11648.

factors analysis；Agave Hybrid No.11648；superoxide dismutase

S563.8

A

1671－3532（2017）03－0142－04

2016－11－16

广东省省级大学生创新创业训练计划项目（201510579264）；湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目（2014A03016）

李婷婷（1994－），女，本科，研究方向为化学。E－mail：1099670064＠qq.com

*通讯作者：陈冰（1964－），女，教授，主要从事天然产物分离与改性、微流控芯片与毛细管电泳。E－mail：858608881＠qq.com