MicroRNA-195对胶质瘤U251细胞株CCND1表达的影响

徐勇明 任书娴 常璐 曲志钊 李亚娜 王宏勤

·基础研究·

MicroRNA-195对胶质瘤U251细胞株CCND1表达的影响

徐勇明1任书娴1常璐1曲志钊2李亚娜2王宏勤2

目的研究microRNA-195对胶质瘤U251细胞株CCND1表达的影响。方法通过脂质体Lipofectamin 2000瞬时转染法将microRNA-195过表达、microRNA-195抑制表达转染胶质瘤细胞株 U251。以空白转染组作为空白对照组 （K组）、microRNA-195过表达转染组为 M组、microRNA-195抑制表达转染组为I组。Real-time PCR检测转染前后microRNA-195的含量以确保转染效率；再通过real-time PCR检测转染前后CCND1mRNA的表达变化；western blotting检测胶质瘤细胞U251中CCND1的表达水平。结果Real-time PCR结果显示M组CCND1mRNA的表达低于I组 （M：758.264＜I：1398.04），western blotting实验显示M组相对I组CCND1表达减少 （M：2029＜I：22365.66）。结论MicroRNA-195对胶质瘤U251细胞株CCND1表达有影响。

微小RNA-195； 细胞周期蛋白D1； 胶质瘤

近年来，microRNA已经成为肿瘤领域研究的热点。MicroRNA是一类长约20～25个核苷酸序列的非编码的内源性单链RNA分子。Lee等[1]首先在线虫胚胎中发现lin-4小分子RNA，并命名为miRNA。microRNA-195定位于染色体的17p13.1，位于人类17号染色体的 6 881 953～6 862 065 bp间，是AK098506基因第7个内含子的部分序列[2]。

有研究报道：microRNA-195靶点多为G1/S期的转换调控因子，而这些因子与肿瘤细胞G1/S期转换调控、 异常增殖、 凋亡密切相关。 过表达microRNA-195可抑制胶质瘤细胞增殖，阻滞细胞周期进展，促进细胞凋亡[2]。利用数据库TargetScan预测microRNA-195的作用靶点，以及目前已经报道的microRNA-195的作用靶点，如 CCND1、CCND3、BCL-2等。CCND1过表达于多种人类肿瘤，包括胶质瘤、结肠癌、淋巴瘤等[3-5]。

因此，为阐明microRNA-195对胶质瘤CCND1的影响，并初步验证CCND1为microRNA-195的作用靶点，笔者采用real-time PCR、western blotting检测转染前后CCND1的变化。

材料与方法

一、材料

人脑胶质瘤细胞株U251（武汉博士德生物工程有限公司）；质粒miRNA-195过表达，miRNA-195抑制表达（广州锐博）；CCND1鼠抗人（美国sigma）；βactin鼠抗人（武汉三鹰）；Lipofectamine 2000转染试剂（美国 Invitrogen公司）；胎牛血清（美国 Sigma公司）。

二、方法

1.细胞培养：人脑胶质瘤细胞株U251，细胞常规培养在含10%新胎牛血清、青霉素100 IU/ml和链霉素100 IU/ml的RPMI1640培养液中置于5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱中。每48 h更换一次新鲜培养液并在倒置显微镜下观察细胞生长状况。48～72 h用0.25%的胰蛋白酶消化传代细胞1次，取对数生长期的细胞用于实验。

2.瞬时转染：在6孔板中接种对数期细胞，每组设5个平行孔，在37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞密度为60%左右开始转染，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染，实验分为microRNA-195过表达组、microRNA-195抑制表达组、空白转染组，转染后6 h换含10%小牛血清的培养液，继续培养以用于后续实验。

3.RNA的提取：材料均用0.1%焦碳酸二乙酯水处理，排除RNA酶的干扰。按照RNA提取步骤进行，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定RNA的纯度和浓度。A260/A280比值控制在1.8～2.2。

4.反转录合成 cDNA反应：使用 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit进行反转录反应。配制反应液（反应液配制在冰上进行）在0.2 ml的离心管中加入下列反应体系，条件按说明书进行设置。将合成的cDNA储存于-20℃备用。

5.检测microRNA-195相对表达量：采用realtime PCR检测U251转染前后microRNA-195相对表达量，评估转染效率。分别计算microRNA-195及U6基因的Ct值，△Ct=Ct目的基因-CtU6内参，△△Ct=Ct转染组-Ct对照组，采用2-△△Ct值表示结果，实验重复3次。

6.检测CCND1mRNA的表达水平：使用prime3.0设计引物设计CCND1引物序列，CCND1：上游引物5’-3’：GCATGTTCGTGGCCTCTAAG，下游引物5’-3’：CGTGTTTGCGGATGATCTGT；GAPDH：上游引物5’-3’：CCACGATAACACCAGCTTCG，下游引物5’-3’：ACTTGAGCATGTAGGCCTGT，引物由广州锐博合成。Real-time PCR检测U251转染前后CCND1mRNA相对表达量。采用相对定量比较CT值法：△Ct= CtCCND1-CtGAPDH，△△Ct=Ct转染组-Ct对照组，采用2-△△Ct值表示结果，实验重复3次。

7.Western blotting实验：收集对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化法提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白含量，配平蛋白浓度，再按20μl蛋白+5μl蛋白上样缓冲液混匀后置于金属仪中100℃变性5 min。配制5%浓缩胶及12%分离胶，点样后90 V电压下电泳30 min，130 V电压下电泳90 min，转膜90 min，5%封闭液封闭2 h，孵育相应一抗于4℃过夜，TBST洗3次，每次洗10 min，加二抗孵育2 h，TBST洗3次，每次洗10 min，之后放于凝胶成像分析系统下进行显影。

三、统计学分析

采用SPSS18.0统计学软件进行分析，多个样本比较采用单因素方差分析，结果以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、各组microRNA-195相对表达量

转染48 h后，收集细胞沉淀，提取RNA，realtime PCR检测各组 microRNA-195相对表达量，microRNA-195过表达组与空白对照组相比，microRNA-195相对表达量增加，差异均有统计学意义（t=2.877，P=0.035）；microRNA-195抑制表达组与空白对照组相比，microRNA-195相对表达量减少， 差异有统计学意义 （t=2.437，P=0.001）；而microRNA-195过表达组与microRNA-195抑制表达组比，差异更加明显，有统计学意义（t=2.215，P= 0.001）；表明转染效果好（图1）。

二、CCND1mRNA在人脑胶质瘤U251细胞中的表达变化

图1 各组microRNA-195相对表达量

Real-time PCR实验发现：microRNA-195过表达组CCND1mRNA表达量明显低于microRNA-195抑制表达组，空白对照组处于microRNA-195过表达 组 与 microRNA-195抑制表达组之间，而microRNA-195过表达组是转染microRNA-195 mimics组，microRNA-195抑制表达组是转染microRNA-195 inhibitors组，microRNA-195过表达组中microRNA-195表达高于microRNA-195抑制表达组，从而说明microRNA-195可抑制胶质瘤U251细胞CCND1mRNA的表达，见图2。

图2 各组CCND1mRNA相对表达量

三、CCND1在蛋白表达上的变化

Western blotting分别检测转染后各组CCND1蛋白、β-actin蛋白的表达量，结果显示microRNA-195过表达组与microRNA-195抑制表达组及空白对照组相比，CCND1蛋白相对蛋白表达量水平明显减少，差异均有统计学意义 （t=9.495，P=0.000），与CCND1mRNA的表达结果一致。结合CCND1mRNA和 CCND1蛋白表达的结果，证明 miR-195对CCND1的表达有影响 ，并初步证实在胶质瘤U251细胞中，CCND1为microRNA-195的靶标（图3）。

图3 以β-actin为参照western blotting检测各组CCND1蛋白的表达

讨论

证据表明，细胞周期蛋白家族的表达可受microRNA控制。据报道，microRNA-17、microRNA-20a、microRNA-106b直接针对 3’-UTR协同调控CCND1的表达，影响干细胞细胞周期进程[6]。本研究发现microRNA-195上调抑制CCND1的表达，下调反之。总之，microRNA-195可以通过调节CCND1的表达间接调控细胞周期。

作为细胞周期调节因子家族成员，CCND1过度表达可使细胞G1期缩短，体积变小，对分裂原的依赖性减弱，CCND1已被确认为致癌基因[7]。据报道，细胞周期素D1表达水平与肿瘤的恶性程度相关，包括胶质瘤、乳腺癌、膀胱癌等[8-10]。 细胞周期蛋白D1是众所周知的调节细胞周期进程，对肿瘤细胞的生长起重要作用的蛋白[11]。MicroRNA-195是一类调控RNA小分子，以序列特异性的方式控制它们的靶标mRNA基因表达[12]。在多种致癌过程，已被确定为关键的监管机构，如细胞增殖、血管生成、细胞分化、侵袭和转移，并可作为肿瘤抑癌基因或癌基因[13,14]。

本研究表明转染microRNA-195类似物的U251胶质瘤细胞中 CCND1mRNA低表达，而转染microRNA-195抑制剂的 U251胶质瘤细胞中CCND1mRNA呈现高表达。不仅如此，western blotting的结果也与其结果一致，这符合数据库的预测，表明microRNA-195不仅在乳腺癌、结肠癌等能靶向调控 CCND1，同样在胶质瘤中也能调控CCND1，并对其表达产生影响，但具体作用机制还有待研究。

胶质瘤发病率不断上升，而临床治疗手段仍没有大的变化，主要还是使用替莫唑胺进行化疗，随着替莫唑胺在临床治疗上的广泛应用，许多胶质瘤患者对其已经产生耐药，如替莫唑胺能通过激活PI3K/AKT信号途径导致胶质瘤细胞对TMZ不敏感甚至产生耐药，而替莫唑胺发挥疗效主要是影响细胞周期，影响有关细胞周期蛋白，包括CCND1、CCNE1等[15]。本研究证明microRNA-195对胶质瘤U251细胞株CCND1表达有影响，初步验证数据库的预测，microRNA-195在胶质瘤U251细胞株中靶向调控CCND1，因此可预测，microRNA-195可能在改善胶质瘤患者对替莫唑胺耐药上有益，microRNA-195可能参与胶质瘤替莫唑胺化疗耐药机制，有待进一步实验。

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Effect o f microRNA-1 95 on the expression of CCND1 in glioma U251 cell

Xu Yongming1,Ren Shuxian1,Chang Lu1,Qu Zhizhao2,Li Yana2,Wang Hongqin2.1Department of Neurosurgery,The Graduate School of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2Department of Neurosurgery, The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

Wang Hongqin,Email:whq1968hq@163.com

Objective To research the effect of microRNA-195 on the expression of CCND1 in glioma U251 cell.MethodsMicroRNA-195 mimics,microRNA-195 inhibitors were transfected into human glioma U251 cell by lipofectamine 2000 transient transfection.The microRNA-195 mimics transfection group was M group,and the microRNA-195 inhibitors transfection group was group I(blank control group,K group).Real-time PCR was used to detect the content of microRNA-195 before and after transfection to ensure the transfection efficiency.The expression of CCND1 mRNA was detected by realtime PCR.The expression of CCND1 in glioma U251 cells was detected by western blotting.ResultsReal-time PCR results showed：the expression of CCND1 mRNA in group M was lower than that in group I（M：758.264＜I：1398.04）;western blotting：the expression of CCND1 was decreased in M group compared with I group(M：2029＜I：22365.66).ConclusionMicroRNA-195 has an effect on the expression of glioma U251 cellline CCND1.

MicroRNA-195;CCND1;Glioma

2017-03-09）

（本文编辑：张丽）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.03.007

国家自然科学基金（81470115）

030001 太原，山西医科大学研究生院1；030001 太原，山西医科大学第一医院神经外科2

王宏勤，Email：whq1968hq@163.com

徐勇明,任书娴,常璐,等.MicroRNA-195对胶质瘤U251细胞株CCND1表达的影响[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志, 2017,3(3)：155-158.