高灵敏检测葡萄糖的新型荧光纳米传感器

李爱琴+郭唱+许苏英

摘 要 构建了一种用于高灵敏检测葡萄糖的新型荧光纳米传感器。在辣根过氧化物酶（HRP）的催化下，H2O2氧化3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB），生成具有强吸光性质的TMB多聚体，导致1氧1H非那烯2，3二腈（1Oxo1Hphenalene2，3dicarbonitrile， OPD）分子的荧光发生淬灭，基于此实现H2O2的定量检测，线性范围分别为0.05～0.80 μmol/L和1～10 μmol/L，检出限（3 ）为0.02 μmol/L。由于葡萄糖氧化酶（Gox）可催化葡萄糖分解产生H2O2，基于此可以实现葡萄糖分子的定量检测，线性范围分别为0.1～3.0 μmol/L和4.0～30 μmol/L， 检出限（3 ）为0.02 μmol/L。将本方法用于实际血清样品中葡萄糖的定量检测，结果与临床检测结果相符。

关键词 有机荧光探针； 荧光传感器； 过氧化氢； 葡萄糖； 血清

1 引 言

近年来，由于生活水平的提高、饮食结构的改变以及不良生活方式等因素，糖尿病在全球的发病率迅速增长，在中国更呈现爆发式增长。灵敏、快速、准确地测定血液中的葡萄糖含量是诊断、治疗以及控制糖尿病发展的重要环节，具有非常重要的意义[1～3]。目前，临床检测葡萄糖的主要方法为生化酶检测法，包括己糖激酶法（HK）和葡萄糖氧化酶法（GOD）法[4～6]。如Liu等[4]通过制备上转换发光纳米探针并利用GOD法，实现过氧化氢和葡萄糖的高灵敏检测；夏畅等[6]将石墨烯量子点银纳米颗粒复合物用于葡萄糖的比色检测。近年来，文献报道了很多葡萄糖检测方法，如基于小分子传感探针、电化学测定法、高效液相色谱法以及毛细管电泳法等[7，8]。荧光法因具有灵敏度高、检出限低等优点，受到广泛关注。作为一种灵敏的有机荧光分子，1氧1H非那烯2，3二腈（1oxo1Hphenalene2，3dicarbonitrile， OPD）的发射波长在600 nm的红光范围内， 同时具有双光子成像能力[9～12]。Zhang等[12]报道了基于OPD芳香取代反应，用于细胞内半胱氨酸的高灵敏识别的研究。基于OPD的优良荧光特性，本研究利用双亲高分子包覆OPD分子制备在水相体系中具有良好稳定性的荧光纳米颗粒，将其用于葡萄糖识别体系中，从而建立了高灵敏的葡萄糖响应OPD荧光纳米传感器，并考察了其检测性能。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

F4600荧光光谱仪（日本日立公司）；UV3600紫外光谱仪（日本岛津公司）；JEM 1200EX透射电子显微镜（日本电子株式会社）。

蒽醌（95%）、丙二腈（99%）购自百灵威科技有限公司；有机溶剂如无水乙腈、氯仿等购自北京化学试剂公司；聚琥珀酰亚胺（PSI）购自石家庄德赛化工有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）购自上海紫一试剂厂；3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB）与葡萄糖氧化酶（Gox）购自日本和光纯药工业株式会社。人血清来自陆军总医院。除特别标注外，所有试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。

2.2 实验方法

2.2.2 油胺接枝聚琥珀酰亚胺功能高分子（PSIOAm）的合成[14] 合成路线如图1B所示。将0.6 g PSI在加热条件下溶于32 mL DMF中，加入1.95 mL油胺，100℃反应4 h；冷却后加入甲醇使其沉淀，离心分离，真空干燥，得到双亲功能高分子PSIOAm。

2.2.3 荧光分子的表面修饰[14] 取9 mg PSIOAm溶于0.5 mL氯仿中，0.1 mg OPD溶于0.5 mL乙腈中，二者加入到10 mL 10 mmol/L NaOH溶液，超声乳化。PSIOAm在碱性条件下发生水解，原有的酰亚胺环开环反应变成亲水的羧基，经超声乳化，形成水包油体系，有机疏水纳米颗粒表面包覆一层双亲高分子。在45℃蒸去氯仿，得到均一稳定的荧光纳米颗粒溶液（OPD@PSIOAm）。

2.2.4 H2O2的检测体系 将50.0 μL OPD@PSIOAm溶液、50.0 μL TMB溶液（1.0 mg/mL）、50.0 μL HRP（1.0 mg/mL）和 100 μL不同浓度的H2O2 （ 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、30、40、50、60、70、80＼，90＼，100＼，150和200 μmol/L）混合，补加0.02 mol/L NaACHAC缓冲溶液（pH 5.0）至1 mL，在37℃孵育30 min，测试荧光光谱，激发波长为500 nm。

2.2.5 葡萄糖的检测 50.0 μL Gox （2.0 mg/mL）加入100 μL不同浓度的葡萄糖（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、20、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350和400 μmol/L）， 37℃孵育10 min得溶液a。50.0 μL OPD@PSIOAm、50.0 μL TMB溶液（1.0 mg/mL）、50.0 μL HRP溶液（1.0 mg/mL）和150 μL上述溶液a混合，补加NaACHAC缓冲溶液至1 mL。混合溶液在37℃孵育30 min，测定荧光光谱。

2.2.6 血清中葡萄糖含量的检测 血清样本用20.0 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）稀释50倍。100 μL稀釋的血清、50 μL Gox溶液（2.0 mg/mL）的混合溶液在37℃孵育10 min，得到溶液b。50.0 μL OPD@PSIOAm、 50.0 μL TMB溶液（1.0 mg/mL）、 50.0 μL HRP （1.0 mg/mL）和150 μL上述溶液b混合，补加NaACHAC缓冲溶液至1 mL， 在37℃孵育30 min，进行荧光测试。

3 结果与讨论

3.1 OPD@PSIOAm纳米探针制备与表征

OPD有机荧光分子在水中溶解度较小，为了提高其水溶性，使用超声乳化法[14]将OPD包裹，形成水溶性纳米探针OPD@PSIOAm。透射电镜表征（图1C）表面，此颗粒尺寸约为60 nm；测定了其荧光光谱，发现所形成的OPD@PSIOAm纳米颗粒与OPD分子的荧光性质一致，如图1D所示，在最大激发波长500 nm条件下，OPD与纳米探针OPD@PSIOAm均会发出最大发射波长为567 nm的荧光，说明经聚合物修饰不会显著影响有机小分子OPD的荧光性质。

3.2 OPD荧光纳米探针检测H2O2和葡萄糖的机理和可行性分析

葡萄糖在Gox的催化作用下可以转化为葡萄糖酸和H2O2。在HRP存在下，H2O2可以氧化TMB，氧化态的TMB多聚体（oxTMB）可以吸收OPD纳米颗粒的荧光，从而使其荧光淬灭[4，13]。在一定范围内，其荧光强度和H2O2/葡萄糖的浓度成反比，通过检测荧光强度可以定量分析H2O2/葡萄糖。

测定了TMB、HRP及其混合溶液加入H2O2前后的紫外吸收光谱（图2A）和荧光光谱（图2B）。实验结果表明，单独的TMB、HRP以及TMBHRP混合溶液的吸收都很弱。当加入H2O2后，由于H2O2具有强氧化性，可将TMB氧化为具有强吸收的oxTMB。荧光光谱结果也表明，TMB和HRP的混合液，以及H2O2自身对OPD@PSIOAm纳米颗粒的荧光强度几乎没有影响，只有在TMB、HRP和H2O2同时存在的条件下，才可有效淬灭OPD@PSIOAm纳米颗粒的荧光。此结果也表明在HRP催化下，H2O2氧化TMB生成的oxTMB，可有效猝滅OPD@PSIOAm的荧光，基于此可实现对H2O2的检测。

3.3 检测时间和pH值的影响

分别考察了检测时间（图3A）和pH值 （图3B）对检测体系的影响。TMB和HRP浓度均为1.0 mg/mL， OPD@PSIOAm 50 μL，10 μmol/L H2O2。反应时间少于30 min时，加入H2O2后，TMB转化为具有强吸收的oxTMB，导致反应液的荧光强度急剧下降；反应时间达到30 min后，荧光强度趋于稳定。故选定反应时间为30 min。考察了不同pH值对荧光强度的影响，结果表明，pH值对OPD@PSIOAm荧光强度有一定影响。这是因为在不同pH值条件下，HRP催化活性不同，据文献[4]报道，偏酸性环境下，HRP催化活性更强。本研究结果表明，在pH=5条件下，荧光强度变化最为明显，故选择在pH=5的条件下进行后续的分析检测。

基本一致，证明本方法构建的荧光传感器具有潜在的应用价值，为血糖含量的测定提供了一种较为精确的方法。

4 结 论

本研究基于OPD@PSIOAm荧光纳米颗粒以及TMBHRPOPD体系，构建了检测葡萄糖的荧光传感器，具有灵敏度高、选择性强等优点，可用于实际血清样品中葡萄糖的分析检测，为临床检测血糖浓度、开发高灵敏的葡萄糖浓度检测方法提供了新思路。

References

1 Li Z Z， Xin Y M， Wu W L， Fu B H， Zhang Z H. Anal， Chem.， 2016， 88（15）： 7724-7729

2 Li L， Zhang Y， Zhang L N， Ge S G， Liu H Y， Ren N， Yan M， Yu J H. Anal. Chem.， 2016， 88（10）： 5369-5377

3 Ju J， Chen W. Anal. Chem.， 2015， 87（3）： 1903-1910

4 Liu J L， Lu L L， Li A Q， Tang J， Wang S G， Xu S Y， Wang L Y. Biosens. Bioelectron.， 2015， 68： 204-209

5 MA ZhenZhen， YU HuiCheng， WU ZhaoYang， WU Yan， XIAO FuBing. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（5）： 822-827

马真真， 余会成， 吴朝阳， 吴 燕， 肖福兵. 分析化学， 2016， 44（5）： 822-827

6 XIA Chang， HAI Xin， CHEN Shuai， CHEN XuWei， WANG JianHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（1）： 41-48

夏 畅， 海 欣， 陈 帅， 陈旭伟， 王建华. 分析化学， 2016， 44（1）： 41-48

7 Ma C M， Sun Z， Chen C B， Zhang L L， Zhu S H. Food Chem.， 2014， 145： 784-788

8 XIN Hua， CHEN LiBo， SHI HongYan， SONG WenBo， LIU TieMei. Chem. J. Chinese Universities， 2014， 35（3）： 482-487

辛 华， 陈丽波， 史鸿雁， 宋文波， 刘铁梅. 高等学校化学学报， 2014， 35（3）： 482-487

9 Lenk R， Tessier A， Lefranc P， Silvestre V， Planchat A， Blot V. J. Org. Chem.， 2014， 79： 9754-9761

10 Li H L， Liu F Y， Xiao Y， Pellechia P J， Smith M D， Qian X H， Wang G R， Wang Q. Tetrahedron， 2014， 70（35）： 5872-5877

11 Xiao Y， Liu F Y， Qian X H， Cui J N. Chem. Commun.， 2005， 2： 239-241

12 Zhang M， Yu M X， Li F Y， Zhu M W， Li M Y， Gao Y H， Li L， Liu Z Q， Zhang J P， Zhang D Q， Yi T， Huang C H， J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129： 10322-10323

13 Narsingh R N， Shiju A， Vinod K， Anushka B， Anchal S， Preeti S. Biosens. Bioelectron.， 2015， 218： 42-50

14 Huang S， Bai M， Wang L Y. Sci. Rep.， 2013， 3： 2023-2027

15 Liu L W， Luo Y， Wang Y M， Duan L Y， Jiang J H， Yu R Q. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2016， 8： 33439-33445

16 Michael B， Devaraj M， Kathavarayan T， Pundlik R B， Duraisamy S， Sellappan S. Biosens. Bioelectron.， 2017， 91： 380-387

17 Heidari H， Habibi E. Microchim. Acta， 2016， 183： 2259-2266

18 Zheng J Z， Zhang W X， Lin Z Q， Wei C， Yang W Z， Dong P H， Yan Y R， Hu S R. J. Mater. Chem. B， 2016， 4： 1247-1253

Abstract A fluorescence nanosensor based on an easily prepared fluorescent molecule， 1oxo1Hphenalene2，3dicarbonitrile （OPD）， was developed for highly sensitive detection of glucose. Under the catalysis of horseradish peroxidase （HRP）， 3，3′，5，5′tetramethylbenzidine （TMB） was oxidized into oxidized TMB （oxTMB） by H2O2. And the fluorescence of OPD was quenched by the intense absorption of the formed oxTMB， thus realizing effective quantitative detection of H2O2. The linear range was 0.05-0.8 μmol/L and 1-10 μmol/L respectively， with limit of detection of 0.02 μmol/L. Besides， on the basis of transformation of glucose into H2O2 through the catalysis of glucose oxidase， this nanosensor could be further exploited for highly sensitive detection of glucose. The TMBHRPOPD sensor exhibited linear range of 0.1-3.0 μmol/L and 4.0-30 μmol/L respectively for detection of glucose， with limit of detection of 0.02 μmol/L. Furthermore， it was successfully applied to the determination of glucose in real human serum and the results were in good agreement with the clinical data

Keywords Organic fluorescent probes； Fluorescence nanosensor； Hydrogen peroxide； Glucose； Human serum

（Received 23 November 2016； accepted 3 May 2017）