褐飞虱可溶性海藻糖酶的分子特性及dsRNA抑制表达分析

陈坚毅， 张 露， 王莎莎， 丁艳娟， 赵丽娜， 王世贵， 唐 斌

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

褐飞虱可溶性海藻糖酶的分子特性及dsRNA抑制表达分析

陈坚毅， 张 露， 王莎莎， 丁艳娟， 赵丽娜， 王世贵， 唐 斌

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

为探究不同昆虫可溶性海藻糖酶的潜在功能，在获得褐飞虱2个可溶性海藻糖酶NlTRE1-1和NlTRE1-2的cDNA全长序列的基础上，采用生物信息学相关软件分析其序列特征以及二级、三级结构等分子特性及生理功能，同时构建不同昆虫海藻糖酶的系统进化树，进一步采用RNAi技术分析单个海藻糖酶基因抑制效果.结果显示，褐飞虱可溶性海藻糖酶NlTRE1-1和NlTRE1-2蛋白相似性高，其蛋白质二级和三级结构均类似，二级结构中含有相似比例的α螺旋、β-折叠和无规卷曲；系统进化树分析表明褐飞虱海藻糖酶与大豆蚜、豌豆蚜和灰飞虱等昆虫的TRE1具有较近的亲缘关系；且两个褐飞虱特异性TRE1-1和TRE1-2的dsRNA注射后48 h，本基因的表达极显著下降.研究结果为以抑制海藻糖酶基因表达来进行的害虫防治技术奠定基础.

褐飞虱；海藻糖酶基因；序列分析；qRT-PCR；RNA干扰

水稻是中国乃至世界上最重要的食物来源，而褐飞虱(Nilaparvatalugens)是水稻生产中最具毁灭性的害虫之一.褐飞虱属于半翅目飞虱科，是一种单食性水稻害虫，具有繁殖速度快、内禀增长率高、环境适应性强等特点[1-5].海藻糖酶(Trehalase，常简称TRE，Tre或Treh)是昆虫海藻糖代谢中必不可少的一类酶，亦是昆虫体内几丁质合成通路的第一个酶，由于其重要性被称为“血糖”.前期研究根据昆虫的海藻糖酶是否具有跨膜结构将其分为可溶性海藻糖酶(soluble trehalase，简称TRE1、Treh1或TreS)和膜结合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase，简称TRE2、Treh2或TreM)两种类型[6-11]，它们分别为细胞内蛋白和跨膜蛋白，将海藻糖降解为葡萄糖从而为昆虫的运动等生理活动提供能量[12-13].

相关研究报道海藻糖酶不仅能够通过调节昆虫体内海藻糖的浓度抵抗低温、干燥和农药等逆境胁迫[14]，而且能够通过调控几丁质合成通路控制昆虫蜕皮过程中的几丁质合成[15-16].同样，海藻糖酶抑制剂Validamycin能够抑制海藻糖酶的活性，从而调控几丁质代谢，导致昆虫蜕皮困难及死亡[17].因此，海藻糖酶可作为设计新型杀虫剂的潜在靶标.本文在前期获得褐飞虱2个可溶性海藻糖酶cDNA序列的基础上，分析其一、二、三级结构的差异，并采用RNAi技术探索其抑制靶标基因的表达情况，为基于RNAi技术抑制海藻糖酶基因表达的害虫防治奠定基础.

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

本实验室饲养种群，采集于中国水稻研究所，其后在杭州师范大学动物适应与进化重点实验室长期饲养.褐飞虱饲养全部采用感虫水稻品种TN1，水稻和褐飞虱均放在人工气候箱或者人工气候室中培育或者饲养，温度(25±1)℃、相对湿度70%±5%、光周期14L∶10D.

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器

-80 ℃冰箱(艾本德U410-86)，常规冰箱(西门子KK25V61TI)；台式低温离心机(Eppendorf)，台式高速离心机(Eppendorf和Sigma1-14)；高压蒸汽灭菌锅(ZEALWAY GR60DA)，无菌超净工作台(ESCO)，恒温水浴锅(上海精宏DK-8D)，实时荧光定量PCR仪(Bio-RAD CFX96)和微量测定分光光度计(NanoDropTM2000)等.

1.2.2 主要试剂

常规的PCR试剂如6×Loading buffer、DNA Marker DL2000、pMD18-T或pMD20-T、AMV反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂均从大连TaKaRa公司购买；常规和荧光实时定量PCR引物均由上海英潍捷基有限公司合成；总RNA提取采用Trizol试剂盒，购自Lifetech Scientific Corporation；实时荧光定量PCR八连管等耗材购自美国Bio-RAD公司；dsRNA合成试剂盒为T7 RiboMax Express RNAi System(Promega，Madison，USA)；琼脂糖、氯仿、异丙醇、无水乙醇、EDTA等常规试剂均购自国药集团化学试剂有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 褐飞虱总RNA的抽提及cDNA合成

取5～10头褐飞虱放入1.5 mL离心管中，置于冰上，加入100 μL Trizol，电动匀浆器研磨；补足Trizol 至1 mL，用力振荡3 min，室温静置；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，转移上清至新的1.5 mL离心管，加入500 μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置20 min；离心，弃上清，并加入1 mL 75%的乙醇，将沉淀吹离管壁，洗涤沉淀；4 ℃，7 500 r/min离心5 min；倒去上清，加入1 mL 75%的乙醇，将沉淀吹离管壁，洗涤沉淀；离心后倒掉上清，将离心管倒置在超净台上，加入30～50 μL DEPC处理水溶解，吹打混匀；各取1 μL用于电泳检测和分光光度计浓度检测.首先在RNase-free的500 μL EP管中配制基因组DNA的去除体系，再按照Takara Prime Script®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明书要求进行反转录，-20 ℃保存.

1.3.2 PCR扩增、胶回收及T克隆

根据前期褐飞虱的转录组和美国国家生物科技信息学中心网站(NCBI)公布的NlTRE1-1(FJ790319)及NlTRE1-2(KU556829)完整cDNA 开放阅读框序列(Open Reading Frame，ORF)，分别从两端设计特异性引物，进行PCR全长扩增和验证.具体PCR条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，共30个循环，72 ℃充分延伸10 min.反应结束，取 5 μL PCR 产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳.当检测到大小分别为1 700，1 500 bp的目的条带后，回收纯化，进行 T 克隆并连接到T载体中，菌落或者酶切进行验证后，送上海英潍捷基公司测序.

1.3.3 菌落PCR鉴定阳性克隆并测序

取菌落至30 μL ddH2O，用作菌落PCR模板；菌落PCR体系：10×buffer 1.25 μL、dNTP(2.5 Mm)1 μL、正向与反向引物F(10 pmol)各0.5 μL、Hifi(5 U/μL)0.1 μL、菌液0.5 μL、补足灭菌的ddH2O至12.5 μL即可进行PCR.

核酸鉴定菌落PCR产物，电泳后，取3 μL 100 μg/mL Amp和阳性克隆剩余菌液加入3 mL LB液体培养基，过夜摇菌；按照600 μL甘油加800 μL过夜菌液的比例配置菌液送往上海英潍捷基有限公司测序.

1.3.4 序列分析与系统进化树分析

将克隆测出的cDNA序列与NCBI数据库进行比对分析.同时，使用SOPMA在线分析软件，进行NlTRE1-1和NlTRE1-2的二级结构预测，并采用SWISS-MODEL进行蛋白质三维结构的预测.利用MEGA7软件中的NJ法构建系统进化树.

1.3.5 褐飞虱可溶性海藻糖基因dsRNA引物的设计及体外合成

利用Primer5和DNASTAR分别设计褐飞虱可溶性海藻糖酶NlTRE1-1和NlTRE1-2的全长ORF扩增及dsRNA引物，具体引物序列见表1.

表1 NlTRE1-1，NlTRE1-2 ORF和dsRNA合成及荧光实时定量PCR引物序列Tab. 1 Primers used for ORF, dsRNA synthesis and qRT-PCR of NlTRE1-1 and NlTRE1-2

T7：GGATCCTAATACGACTCACTATAGG.

分别以含有NlTRE1-1、NlTRE1-2和GFP的质粒DNA为模板，通过交叉PCR反应获得用于体外转录dsRNA的模板.交叉PCR分为: A反应的正向引物带有T7启动子，PCR产物作为转录合成正义RNA的模板；B反应的反向引物带有T7启动子，PCR产物作为转录合成反义RNA的模板[9,18].按照Omega说明书进行胶回收，用NanoDropTM2000测定回收的cDNA的浓度，OD(260/280)和OD(260/230)值均位于1.8～2.2较好，可避免一些蛋白质和杂质离子等抑制cDNA的反转录.然后参照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒说明书进行dsRNA的合成.

1.3.6 dsRNA的纯化及注射

向离心管中加入4.4 μL 3 mol/L醋酸钠，110 μL 95%乙醇，轻轻混匀，冰上放置；离心10 min，弃上清；加入0.5 mL 70%的冰乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清；室温干燥后，加入50 μL DEPC处理水溶解沉淀；电泳检测，NanoDropTM2000测定合成的dsRNA的浓度；-80 ℃长期保存.

将5龄褐飞虱用CO2麻醉后放置于制备有琼脂胶板的一次性培养皿中，使虫体腹部朝上，注射第一对足中间偏下较软部位，每头注射量为200 ng(海藻糖酶抑制剂注射量相同)，注射后将其放置于装有新鲜水稻的试管中，48 h后取整体褐飞虱材料用于后期的实时荧光定量PCR检测与分析[19].

1.3.7 实时荧光定量PCR及数据分析

反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s， 55～60 ℃退火延伸25 s；绘制65～95 ℃溶解曲线.每个样品至少重复3次，3个复孔的CT值相差不超过0.5可用，取平均值用于计算，处理组为NlTRE1-1和NlTRE1-2的dsRNA处理组，以褐飞虱dsGFP注射组为对照.采用2-△△CT法计算特异性基因的表达水平.

2 结果

2.1 褐飞虱TRE1-1和TRE1-2 cDNA序列分析

克隆得到褐飞虱海藻糖酶TRE1-1和TRE1-2cDNA开放阅读框的长度分别为1 692，1 475 bp；翻译成蛋白的氨基酸数目分别为564，492个；预测的蛋白等电点分别为5.51和4.99；预测蛋白的分子质量分别为65.5，57.9 kD.这2个TRE1(图1)都无跨膜结构，但都具有保守的海藻糖酶信号序列“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”[6,13](存在个别蛋白的差异).

起始密码子和终止密码子用加粗斜体下划线表示，dsRNA合成引物序列用大框表示，定量PCR引物序列用小框表示，标签序列用黑底表示.图1 褐飞虱TRE1-1和TRE1-2核苷酸和氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences of TRE1-1 and TRE1-2 from N. lugens

2.2 褐飞虱TRE1及昆虫可溶性海藻糖酶系统进化分析

从NCBI数据库中获取已知昆虫的可溶性海藻糖酶蛋白序列、褐飞虱的TRE2蛋白序列、东亚飞蝗(Locustamigratoria)和异色瓢虫(Harmoniaaxyridis)的TRE2-like蛋白序列一起进行系统进化分析.结果发现褐飞虱TRE1-1和TRE1-2与大豆蚜(Aphisglycines)、豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)及灰飞虱(Laodelphaxstriatella)的可溶性海藻糖酶具有较近的亲缘关系(图2).除异色瓢虫的TRE1-3和TRE1-4外，鞘翅目的异色瓢虫、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)和黄粉虫(Tenebriomolitor)可溶性海藻糖酶聚集在相近的分支上.

图2 昆虫海藻糖酶氨基酸序列系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of TREs amino acid sequences from various insects

2.3 褐飞虱TRE1-1和TRE1-2的二级结构及三级结构预测分析

褐飞虱的TRE1-1和TRE1-2为无跨膜结构的可溶性海藻糖酶.且两个TRE1的二级结构相似，其无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠所占比例相近(图3).具体为：TRE1-1和TRE1-2的无规则卷曲所占比例分别为47.70%和47.15%；α-螺旋分别为43.44%和46.14%；β-折叠比例分别为6.74%，5.89%.

蓝色代表α-螺旋；红色代表β-折叠.SOMPA:http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html.图3 SOMPA在线软件分析TRE1-1和TRE1-2二级结构Fig. 3 The prediction of the secondary structure of TRE1-1 and TRE1-2

在分析NlTRE1-1和NlTRE1-2蛋白质二级结构的基础上，采用SWISS-MODEL对两个NlTRE1进行蛋白质三维结构的预测.结果表明NlTRE1-1和NlTRE1-2的蛋白质三级结构十分相似，TRE1-1和TRE1-2的3D结构近似球体，存在着较多较长的α螺旋结构和很少量的β折叠，以及一些无规则卷曲.

图4 褐飞虱TRE1-1和TRE1-2蛋白质三维结构预测Fig. 4 The prediction of three dimensional structure of TRE1-1 and TRE1-2

2.4 褐飞虱TRE1-1和TRE1-2的RNAi效果分析

在获得合适的褐飞虱dsTRE1-1、dsTRE1-2和dsGFP的RNA(图5)后，注射到褐飞虱体内48 h，实时荧光定量PCR结果显示两个处理组的NlTRE1-1和NlTRE1-2在mRNA水平下降，与对照注射dsGFP组相比较都存在极显著性差异(图6).该结果显示外源褐飞虱TRE1-1和TRE1-2的dsRNA注射后可有效抑制TRE1-1和TRE1-2本基因的表达.

1：TRE1-1；2：TRE1-2；3：GFP.图5 dsTRE1-1, dsTRE1-2, dsGFP合成电泳图Fig. 5 Agrosegel electrophresis of dsTRE1-1, dsTRE1-2 and dsGFP

图6 荧光定量PCR检测TRE1-1和TRE1-2表达分析Fig. 6 The expression analysis of TRE1-1 and TRE1-2 by qRT-PCR

3 讨论

海藻糖是昆虫的“血糖”，海藻糖酶是昆虫中唯一能够水解海藻糖的酶，由海藻糖酶基因编码.考虑到海藻糖酶不仅能降解海藻糖，而且能够通过调控海藻糖的降解调控昆虫几丁质的合成途径，因此，关于昆虫海藻糖酶及其基因功能的研究一直受到众多研究者的关注.1992年，昆虫海藻糖酶在黄粉虫中被发现并确定为可溶性海藻糖酶基因[20].而后膜结合型的海藻糖酶也在Bombyxmori中克隆和报道[12].目前，许多昆虫中已经发现两类海藻糖酶基因，大多数昆虫中仅包含了一个可溶性海藻糖酶和一个膜结合型海藻糖酶基因.昆虫的海藻糖酶都包含了“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”两个保守的标签序列[6]，不同昆虫之间也会存在个别蛋白的差异，褐飞虱TRE1-1的标签序列为“PGGRFRELYYWDTY”和“QWDFPNAWAP”，而TRE1-2的标签序列为“PGGTSRELHYWDSY”和“KWDFPNAWAP”(图1).

系统进化分析表明，褐飞虱的两条TRE1蛋白与大豆蚜、豌豆蚜和灰飞虱具有较近的亲缘关系，它们聚集在一起(图2).随着转录组和基因组测序的发展，在鞘翅目的赤拟谷盗和异色瓢虫中分别发现4～5条可溶性海藻糖酶基因[14,21-22]，且在东亚飞蝗和褐飞虱中发现了2条可溶性海藻糖酶基因序列.然而，在东亚飞蝗和异色瓢虫中发现一类无跨膜结构、但与膜结合型蛋白同源性高且聚集在一支的类似膜结合型海藻糖酶(membrane-bound like trehalase，简称TRE2-like或TreM-like)[9,17-18,23-24]，其与褐飞虱TRE2蛋白聚集在一支上(图2)，这类类似膜结合型海藻糖酶极有可能为可溶性海藻糖酶进化到膜结合型海藻糖酶的中间类型.虽然昆虫的海藻糖由海藻糖酶来控制，但是相关结果推测不同昆虫组织海藻糖降解可能由不同种类的海藻糖酶直接负责，不同的可溶性海藻糖酶基因存在着不同分工.

海藻糖酶活性受激素的调节[25-26]，而20E(20-基蜕皮甾酮)同样能够调节甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)SeTRE1的表达来调控海藻糖酶的活性[27].在褐飞虱中，TRE1-1和TRE1-2的dsRNA能够有效地抑制本基因在RNA干扰48 h后mRNA水平上的表达(图6)，且降低可溶性海藻糖酶活性、几丁质合成酶(Chitin synthase)和几丁质酶(Chitinase)的表达，从而导致几丁质含量下降、蜕皮困难及死亡[9].因此，通过RNAi技术或者采用海藻糖酶抑制剂能够有效抑制海藻糖酶基因的表达[17]，并控制害虫的蜕皮过程和几丁质代谢，这为开发潜在的海藻糖酶抑制剂或合适的RNAi方法用于生物防治提供可能性，将有助于推动以海藻糖代谢途径中关键基因如海藻糖酶基因为靶标的害虫生物防治工作的发展.

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Molecular Characterization of Soluble Trehalase and Expression of dsRNA inNilaparvatalugens

CHEN Jianyi, ZHANG Lu, WANG Shasha, DING Yanjuan, ZHAO Lina, WANG Shigui, TANG Bin

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

In order to explore the potential functions of different insects’ soluble trehalase, basing on the full-length sequence of two soluble trehalase NlTRE1-1 and NlTRE1-2 cDNAs, the sequence characteristics as well as the secondary and tertiary structures of two TRE1 inNilaparvatalugenswere analyzed using the bioinformatics software. Then, the phylogenetic tree of trehalase from different insects was constructed. And the effect of single trehalase gene by RNAi technique was studied. These results showed that the soluble trehalase NlTRE1-1 and NlTRE1-2 proteins had high similarity, their protein secondary and tertiary structures were similar. The secondary structure contained similar ratio α-helix, β-sheet and random coil. The phylogenetic tree analysis showed that two trehalase ofN.lugenshad a close genetic relationship with the TRE1 ofAphisglycines,AcyrthosiphonpisumandLaodelphaxstriatella. The expression of this gene was significantly decreased when the two specific TRE1-1 and TRE1-2 dsRNAs were injected 48 h. This study results provided a basis for the prevention and treatment of pests that inhibited trehalase gene expression.

Nilaparvatalugens; trehalase gene; sequence analysis; qRT-PCR; RNA interference

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.03.007

2016-12-23

国家自然科学基金项目(31371996，31672081)；杭州市科技局计划项目(20140432B01).

唐 斌(1980—),男,副研究员,博士,主要从事昆虫海藻糖代谢及调控相关研究.E-mail:tbzm611@163.com

Q966；S476

A

1674-232X(2017)03-0260-08