南瓜SCoT-PCR反应体系的优化与引物筛选

王丰丰，王萍，石磊，杨静，杨琴

（内蒙古野生特有蔬菜种质资源与种质创新重点实验室·内蒙古农业大学农学院呼和浩特010019）

南瓜SCoT-PCR反应体系的优化与引物筛选

王丰丰，王萍，石磊，杨静，杨琴

（内蒙古野生特有蔬菜种质资源与种质创新重点实验室·内蒙古农业大学农学院呼和浩特010019）

为了构建适合南瓜SCoT-PCR反应的最佳体系，笔者对需要控制的5个变量使用L25(56)正交试验设计。结果表明，最佳优化体系为：2.5 mmol·L-1Mg2+、0.40 mmol·L-1dNTPs、0.5 U Taq酶、1.00 μmol·L-1引物、30 ng模板DNA，共20 μL。然后从51个SCoT引物中筛选出多态性明显的引物20个,并优化最适退火温度。最后，对所得优化体系进行可行性验证。该体系有利于SCoT标记在南瓜材料上的应用，构建的优化体系及筛选出的引物可为南瓜分子遗传育种奠定基础。

南瓜；SCoT-PCR；体系优化；正交设计；引物筛选

南瓜，葫芦科南瓜属[1]，按经济栽培种可分为5大类：美洲南瓜、印度南瓜、中国南瓜、黑籽南瓜和灰籽南瓜。美洲南瓜的嫩瓜味道可口、耐贮藏，在果实成熟早期收获炒食或作馅均可[2]，是不可或缺的淡季蔬菜；印度南瓜和中国南瓜的老熟果实淀粉含量较高，营养价值丰富，可作为饲料或杂粮食用，取其果实可熬制南瓜粥，味道甘甜，而南瓜籽可作瓜子食用；黑籽南瓜以作砧木为主；灰籽南瓜的作用还有待研究。所以，对于南瓜新品种的选育是十分必要的。在南瓜材料上，RAPD、SSR、ISSR等分子标记方法都已经被成功应用[3-5]，而新的分子标记方法——目标起始密码子多态性（Start codon target⁃ ed polymorphism，SCoT）分子标记尚未见相关报道。

SCoT标记是Collard和Mackill[6]在水稻上提出的一种基于单引物扩增反应（single primer amplifica⁃tion reaction，SPAR）的新型分子标记。该标记根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼保守序列来设计单引物，扩增产生偏向候选功能基因区显性多态性标记，具有成本低、操作简单、引物通用性更强、遗传信息完整[7]等优点，在柑橘、葡萄、铁皮石斛、籽用西瓜等植物上得到迅速应用[8-11]。本试验拟构建南瓜SCoT-PCR优化体系并筛选合适的引物，为SCoT分子标记在南瓜分子遗传方面的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

体系优化所用材料为南瓜‘特丰一号’，引物筛选所用材料为4个南瓜地方品种，品种编号为2、7、14、21，验证材料为来自不同地区的20个南瓜地方品种，品种编号为2～21（详见表1）。DNA模板提取自南瓜幼嫩真叶。SCoT引物序列来自于Collard等[6]的报道，由上海生工生物工程有限公司合成。基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司，dNTPs、Taq DNA聚合酶、10× Buffer、DL2000 Marker等均从全式金生物工程有限公司采购。

表1 供试材料

1.2 基因组DNA的提取与检测

南瓜种子温汤浸种后放到装有双层滤纸的培养皿中保持湿润，长至2～3片真叶时，摘下幼嫩真叶清洗，迅速放到研钵中，加入液氮研磨至粉末并装至2 mL PCR管中，置于-20℃冰箱保存备用。提取DNA样品，1%琼脂糖凝胶电泳[12]，电压120 V，时间1 h，使用紫外分光光度法检测，置于-20℃条件下保存备用。

1.3 SCoT-PCR反应体系正交设计

SCoT引物使用的是SC25，正交试验设计采用L25(56)正交表（表2），设计出25组正交组合，对影响PCR反应体系的5大主要因素Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶和DNA模板用量进行优化，每个影响因素有5个水平（表3）。SCoT-PCR反应体系共20 μL，包括5个因素的不同水平，每个体系添加2.0 μL的10×Buffer，加ddH2O至终体积。正交设计表共25个处理，每个处理3次重复。

表2 SCoT-PCR反应体系L25(56)正交设计及直观分析

表3 L25(56)正交试验的因素及水平

1.4 SCoT-PCR扩增及检测

PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，47.7℃复性退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸5 min。得到扩增产物于4℃下保存。取4 μL的扩增产物与2 μL的6×Load⁃ing buffer混匀，在经Gelview核酸染料染色后的1%（ω，下同）琼脂糖凝胶上进行电泳，电极缓冲液为0.5×TBE，电压120 V，时间1 h，最后在紫外凝胶成像系统上拍照保存。

1.5 数据统计与处理

对凝胶图片采用姜小凤等[13]和何正文等[14]的方法进行综合打分。设定打分范围1～25，依次从条带清晰度、数目多少及多态性高低来比较分析，条带好的记为25，差的记为1，按此比较排序。根据3个重复打分结果进行直观分析，然后假设不存在交互作用的情况下，计算出试验每个因素下各水平的平均值，该值能够反映因素各水平对反应体系影响程度的大小。Ti为每个因素在同一水平下的试验值之和，Ki为每个因素在同一水平下的数据平均值，R为同一因素不同水平间平均值的极差。这些数值的大小同样反映了该因素对试验结果影响的大小[15]。直观分析后，利用SPSS 18.0软件对所得结果进行方差分析，估计试验误差。最后，综合比较2种分析方法，得出最优反应体系。

1.6 多态性SCoT引物筛选和退火温度的确定

采用1.5中得出的最优反应体系，以各因素确定浓度为基础进行适合引物的筛选及引物最佳退火温度的试验（表4）。

表4 ScoT引物筛选及最适退火温度

1.7 反应体系的稳定性和可行性检测

选取多个引物对20份南瓜材料进行PCR扩增，在经Gelview核酸染料染色后的1%琼脂糖凝胶上电泳，然后在紫外成像系统上拍照检测，以验证反应体系的稳定性和可行性。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果分析

2.1.1 直观分析对凝胶照片进行直观分析（图1），处理19和25条带是最清晰、多态性最明显的。据此对3个重复进行3次独立打分统计，得到的平均分依次为：1.00，2.33，15.67，18.33，21.00，8.33，20.67，22.33，3.67，3.00，15.00，6.00，20.67，10.00，19.33，5.67，12.00，12.67，24.67，7.00，11.00，18.00，10.33，12.33，24.33。平均分的大小可看作每一水平对试验影响程度的数值表达，将此数值通过计算转变为每个因素对应的影响效果。依次算出Ti、Ki以及对应的R值（表5）。根据直观分析的结果，各因素极差R大小依次为引物浓度＞dNTPs浓度＞Taq酶量＞Mg2+浓度＞模板DNA质量，表明各因素对反应体系的影响程度大小与此顺序相同，其中引物浓度对PCR反应体系影响最大，为主要因素；模板DNA质量影响最小。通过对比直观分析中各因素各水平的平均值可以选出最适水平，这些最适水平结合起来就是最佳组合。

2.1.2 方差分析为了弥补直观分析不能估计试验误差大小的缺点，笔者利用SPSS 18.0软件对统计结果进行方差分析（表6）：从方差分析表中可以看出，各因素对PCR反应体系的影响与直观分析结果一致，其中引物浓度对试验结果影响显著，其他各个因素影响主次也与直观分析一致。总体表明试验误差对试验结果影响较小，因此结果较可靠，可供参考。

图1 SCoT-PCR正交试验扩增产物电泳

表5 正交设计直观分析结果

表6 SPSS18.0方差分析结果

2.1.3 综合分析在2种分析方法综合考虑下，5种因素的最佳水平分别为Mg2+浓度3.0 mmol·L-1、dNTPs浓度0.30 mmol·L-1、Taq酶量1.5 U、引物浓度1.00 μmol·L-1、模板DNA质量40 ng。将SCoT-PCR正交组合对比分析发现，25个组合中并没有出现包含这5种因素最佳水平的组合，但其中分值较高的组合在各方面都与最佳水平较接近，整体符合要求。在综合考量体系中各因素的影响、经济费用及试验质量的前提下，最终确定最优组合为19号组合：2.50 mmol·L-1Mg2+、0.40 mmol·L-1dNTPs、 0.50 U Taq酶、1.00 μmol·L-1引物、30 ng模板DNA，反应总体积20 μL。

2.2 引物筛选

根据综合分析确定的南瓜SCoT-PCR最佳反应体系，以4份地方品种南瓜DNA为模板，对51个引物各自电泳出的4条条带进行多态性分析，筛选出条带清晰、多态性明显的引物共20个，分别为SC3、SC5、SC7、SC9、SC11、SC12、SC13、SC14、SC15、SC16、SC18、SC19、SC20、SC21、SC25、SC29、SC35、SC38、SC54和SC62。部分引物扩增效果见图2，其中引物SC8多态性不明显，不符合引物筛选的要求。

图2 引物SC6、SC8、SC9和SC25多态性的筛选

2.3 引物最佳退火温度选择

退火温度是除了控制变量的5个因素外对试验结果影响最大的一个因素。对筛选出的20个引物逐一进行退火温度的筛选，采用45～58℃温度范围设置12个温度梯度，分别为45.0、46.1、47.2、48.4、49.6、50.9、52.0、53.1、54.2、55.5、56.8、58.0℃。对于每个引物凝胶电泳出的12条条带进行分析，可得到该引物的最适退火温度。部分引物的退火温度筛选见图3。筛选出的20个引物的最适退火温度如表4所示。

图3 引物SC3（左）、SC16（右）退火温度的优化

体系优化时所采用的SC25退火温度筛选结果见图4，该引物退火温度变化不规律，但符合整体趋势。12个退火温度中，在45.0、47.2、50.9℃时，扩增条带少，背景也弱；在46.1、49.6℃时，扩增条带清晰但扩增条带数较48.4℃少；当退火温度上升到55.5、56.8和58.0℃时，扩增条带较少且不清晰。因此，以条带清晰、背景强、条带无杂质作为划分依据，确定本试验中引物SC25的最佳退火温度为48.4℃，此退火温度可以应用在整个体系优化的过程中（其他引物退火温度的筛选过程与此引物相同）。

图4 引物SC25退火温度的优化

2.4 SCoT-PCR反应体系稳定性和可行性检测

虽然已建立起了南瓜SCoT-PCR最佳反应体系，但需要在多基因型条件下进行验证。对反应体系可靠性进行验证采用的是20份南瓜材料（表1），反应体系采用19号组合，唯一变量是20个不同的模板DNA，最后对凝胶照片进行分析，结果发现该体系扩增出清晰的、多态性明显的条带，证实了该体系的稳定性和可行性。在验证过程中，用多个引物配合20份南瓜品种材料才能最大程度减少试验误差，得到最稳定的反应体系。图5是引物SC25对20份南瓜材料进行PCR扩增验证的凝胶电泳图，说明该优化反应体系是可靠的，可以进一步应用于南瓜的分子遗传学研究。

图5 引物SC25对2～21号样品扩增结果

3 讨论

分子标记的诸多优越性使得学者们热衷于分子方面的研究，而目标起始密码子多态性标记也成为了一种颇受欢迎的分子标记方法。所有基于PCR反应技术的分子标记方法都一样，反应体系要受到很多因素的影响，比如Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物和模板DNA等的浓度，还有退火温度，都会影响PCR反应的结果[16]。因此，在对试验材料采用SCoT分子标记方法进行分析时，应首先对其反应体系进行各因素水平的优化，先确定各因素的最优水平，选出最佳的反应体系，再进行后续试验。

退火温度也是影响试验结果的一个关键因素，温度过高条带清晰但少，温度过低有杂带但条带多[17]。在PCR反应体系优化过程中有很多可采用的设计方法，而正交试验设计方法是各种分子标记反应体系优化中应用最为广泛的。该方法不仅综合考虑到了PCR反应体系中各因素间的交互作用，还能避免单因素试验过程中所产生的误差[18]，最终可以快速获得满意的试验结果。当然，该种打分方法也存在一些缺陷，因为在对扩增条带进行打分的过程中，不同的人对条带的清晰度、多态性等的判断标准有差异，受个人主观性影响较大，故评分结果则会产生较大差异[19]。因此，在对条带评分的时候，要多重复、全方面的进行，最大程度地减少主观误差。在对琼脂糖凝胶紫外成像拍照时，注意调整背景亮度、对比度等各种参数，尽量得到最佳的凝胶图片，方便对试验结果的观察分析。

近些年，DNA分子标记技术的应用越来越普遍，各类标记如RAPD、ISSR、SRAP等[3-5]都在南瓜遗传多样性研究中有了初步的应用。肖祖梅[20]将RAPD和ISSR标记相结合，对28份观赏南瓜材料的遗传多样性进行了研究。卢丽芳等[21]利用SRAP分子标记技术对所收集的85份南瓜资源进行亲缘关系分析，从100对引物中挑出17对引物对其进行条带扩增。向成钢等[22]利用SSR标记对20份分属10个品种群的中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜材料及1份印度南瓜和中国南瓜的种间杂交种进行了多态性及亲缘关系分析。与这些标记相比，SCoT分子标记操作更加简单，有利于各种物种SCoT标记技术体系的建立；比ISSR标记更有效地产生和性状连锁的标记，易于分子标记辅助育种；比RAPD标记使用的引物长度更长，重复性好；引物设计趋于简单，在原有引物序列基础上做少许改动来设计更多的新引物，设计好的SCoT标记引物可以在物种间通用。该标记可作为RAPD、ISSR标记技术的有效补充；今后，SCoT标记作为一种新型的目的基因标记，为我们提供了除SRAP、TRAP等标记方法外一种能跟踪性状的新的分子标记技术。

4 结论

笔者采用正交设计方法成功构建了适用于南瓜的SCoT-PCR最佳反应体系：2.5 mmol·L-1Mg2+、0.40 mmol·L-1dNTPs、0.5 U Taq酶、1.00 μmol·L-1引物、30 ng模板DNA，总体积20 μL。采用20个不同品种的南瓜材料对优化的反应体系进行验证，结果表明所有引物均能扩增出特异性丰富的条带，证明了优化的SCoT-PCR反应体系在多基因型条件下的可用性。SCoT分子标记可进一步为南瓜的遗传研究提供标记资源。

[1] 李新峥，孙丽，万国叶．26份南瓜杂交组合（F1）主要农艺性状的分析[J]．中国瓜菜，2013，26（1）：13-16．

[2] 李锡香，朱德蔚．南瓜种质资源描述规范和数据标准[M]．北京：中国林业出版社，2007．

[3] NONTUTHUKO R N，PANGIRAYI B T，ALPHEUS M Z．Genetic diversity in Cucurbita pepo landraces revealed by RAPD and SSR markers[J]．Scientia Horticulturae，2015，189：192-200．

[4] 朱海生，卢丽芳，温庆放，等．南瓜ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]．分子植物育种，2014，12（4）：802-809．

[5] M FERRIOL，B PICÓ，F NUEZ．Genetic diversity of a germ⁃plasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP mark⁃ers[J]．Theoretical and Applied Genetics，2003，107（2）：271-282．

[6] COLLARD B C Y，MACKILL D J．Start Codon Targeted （SCoT）Polymorphism：A simple，novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]．Plant Molec⁃ular Biology Reporter，2009，27（1）：86-93．

[7] 熊发前，唐荣华，陈忠良，等．目标起始密码子多态性（SCoT）：一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术[J]．分子植物育种，2009，7（3）：635-638．

[8] 韩国辉，向素琼，汪卫星，等．柑橘SCoT分子标记技术体系的建立及其在遗传分析中的应用[J]．园艺学报，2011，38（7）：1243-1250．

[9] 张君玉，郭大龙，龚莹，等．葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化[J]．果树学报，2011，28（2）：209-214．

[10] 赵瑞强，高燕会，章晓玲，等．铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化[J]．核农学报，2012，26（4）：648-655．

[11] 杨静，王萍，石磊．籽用西瓜SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选[J]．西北农业学报，2016，25（6）：1-8．

[12] 黄永莲．琼脂糖凝胶电泳实验技术研究[J]．湛江师范学院学报，2009，30（6）：83-85．

[13] 姜小凤，高燕会，童再康，等．石蒜属植物SCoT-PCR反应体系构建及优化[J]．浙江农林大学学报，2013，30（3）：444-452．

[14] 何正文，刘运生，陈立华，等．正交设计直观分析法优化PCR条件[J]．湖南医科大学学报，1998，23（7）：403-404．

[15] 任羽，王得元，张银东，等．辣椒SRAP-PCR反应体系的建立与优化[J]．分子植物育种，2004，2（5）：689-693．

[16] 李勇，朱永春．基于琼脂糖凝胶电泳的小麦SSR扩增体系优化[J]．华北农学报，2009，24（6）：174-177．

[17] 周鹏，王萍，石磊，等．籽用西瓜SSR体系的建立与优化[J]．内蒙古农业大学学报，2015，36（4）：38-43．

[18] AHMAD M G，PETER P，ZSOLT P，et al．Efficiency of arbi⁃trarily amplifieddominant markers（SCoT，ISSR，RAPD）for di⁃agnostic fingerprinting in tetraploid potato[J]．American Journal of Potato Research，2011，88（3）：226-237．

[19] 何仁锋，冯尚国，陈喆，等．药用菊花SCoT-PCR反应体系的正交优化[J]．核农学报，2014，28（10）：1781-1789．

[20] 肖祖梅．观赏南瓜种质资源遗传多样性的RAPD和ISSR分析[D]．重庆：西南大学，2008．

[21] 卢丽芳，朱海生，温庆放，等．南瓜种质资源遗传多样性的SRAP分析[J]．热带作物学报，2015，36（12）：2142-2148．

[22] 向成钢，王艳玲，张雪梅，等．SSR标记在南瓜亲缘关系分析中的应用[J]．北方园艺，2013（15）：104-108．

本刊声明

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《中国瓜菜》编辑部

Orthogonal optimization of SCoT-PCR system and primer screening in pumpkin

WANG Fengfeng，WANG Ping，SHI Lei，YANG Jing，YANG Qin

(Key Laboratory of Wild Vegetable Germplasm Resources and Innovation,College of Agronomy,Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010019，Inner Mongolia，China)

A L25(56)of orthogonal design was used to optimize SCoT-PCR(Scodon Targeted Polymorphism Amplification System)of pumpkin in 5 factors such as Taq DNA polymerase,Mg2+,DNA template,dNTPs and primer concentrations. The result showed that the optimized system was as follows:a total volume of 20 μL including 2.50 mmol·L-1Mg2+, 0.40 mmol·L-1dNTPs,0.50 U Taq polymerase，1.00 μmol·L-1primer and 30 ng DNA template.20 primers were selected from the 51 primer combinations test with clear band patterns and abundant polymorphisms.The most suitable annealing temperature of primers were selected.The SCoT-PCR reaction system for SCoT markers of pumpkin could be applied in pumpkin molecular genetics research.

Pumpkin；SCoT-PCR；System optimization；Orthogonal design；Primers screening

2016-09-10；

2016-11-10

内蒙古科技计划项目(20090707，2010704，20110711，20120212)；内蒙古高寒地区高产安全蔬菜生产的研究与创新项目（NDPYTD2013-3）

王丰丰，男，在读硕士研究生，从事蔬菜种质资源与种质创新研究。E-mail:980853124@qq.com

王萍，女，副教授，硕士生导师，主要从事种质资源与种质创新研究。E-mail:wangping@imau.edu.cn