黄芩素对氧化应激状态下白癜风黑素细胞线粒体超微结构和功能的影响

朱龙飞 田 军 坚 哲 张伟刚 刘邦民 李春英 高天文



·论著·

黄芩素对氧化应激状态下白癜风黑素细胞线粒体超微结构和功能的影响

朱龙飞1,2田 军1,3坚 哲1张伟刚1刘邦民1李春英1高天文1

目的： 明确黄芩素对氧化应激状态下白癜风黑素细胞(PIG3V)线粒体超微结构和功能的影响。方法： 常规培养白癜风黑素细胞系PIG3V细胞，分为空白对照组、黄芩素组、H2O2组及黄芩素+H2O2组。电镜观察线粒体超微结构；MTT法检测线粒体活性；流式细胞术检测线粒体膜电位；荧光素酶报告系统检测细胞ATP含量；RT-PCR检测线粒体DNA拷贝数。结果： 与H2O2组比较，黄芩素+H2O2组线粒体结构损害轻，线粒体活性率、膜电位、ATP含量及DNA拷贝数高。结论： 黄芩素减轻氧化应激状态下白癜风黑素细胞线粒体结构和功能损害，增强细胞抗氧化能力。

黄芩素； 白癜风； 黑素细胞； 线粒体； 氧化应激

白癜风的发病机制尚未充分阐明。基于自身免疫学说，临床上外用糖皮质激素、免疫调节剂，以及NB-UVB照射等治疗白癜风，可获一定的治疗效果。但是这些治疗手段对于预防白癜风的复发以及对进展期白癜风的治疗效果明显不足。近年来，氧化应激学说得到普遍关注，并得到一系列实验结果的支持。线粒体是细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)产生的主要部位，正常情况下其具有完善的抗氧化体系，当线粒体功能障碍时出现细胞内ROS堆积，导致线粒体损伤。研究发现，白癜风患者皮损处(角质形成细胞)和皮损周围(黑素细胞及角质形成细胞)细胞线粒体超微结构损害，进一步支持氧化应激致病学说[1]。

我们课题组前期研究证实，黄芩素(Baicalein)抑制p38MAPK通路对抗正常人黑素细胞系(PIG1)氧化应激损伤，同时减少细胞色素C(Cytochrome c, CytC)释放，通过抑制线粒体凋亡途径保护PIG1细胞，但是具体机制尚不明确[2]。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 电镜为捷克FEI公司Tecnai G2型透射电子显微镜；BD FACSAria流式细胞分选仪为美国Backman公司生产；全自动酶标仪、IQ5实时荧光定量PCR仪为美国Bio-rad公司生产；254培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；30% H2O2溶液(分析纯)为西安化学试剂厂产品；黄芩素购自美国Sigma公司；Red cm ROS购自美国Invitrogen公司；MTT试剂盒为碧云天生物技术有限公司生产；ENLITEN®ATP试剂盒购自美国Promega公司；线粒体DNA特征性基因ND4引物(上游序列：CCATTCTCCTCCTATCCCTCAAC；下游序列：CACAATCTGATGTTTTGGTTAAACTATATTT)由生工生物工程公司(上海)股份有限公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 白癜风患者表皮黑素细胞系(PIG3V)由美国伊利诺斯州芝加哥洛约拉大学Caroline Le Poole博士赠送，该细胞系运用逆转录病毒载体转染16型HPV E6和E7开放读码框得来。PIG3V细胞为贴壁生长的人永生化细胞，使用含5%胎牛血清的254黑素细胞培养基(含血清黑素细胞培养基)，细胞种入25 cm2培养瓶、六孔板或96孔板中，恒温培养箱培养，培养条件设置为37℃，5% CO2。

1.2.2 实验分组及处理 依照我们课题组前期实验的结果，我们采用0.75 mM H2O2培养基处理PIG3V细胞建立氧化应激模型[3]。对照组：黑素细胞培养基；单纯黄芩素处理组：40 μM黄芩素液处理1 h，其后换用黑素细胞培养基。氧化应激组：0.75 mM H2O2处理；黄芩素预处理组：40 μM黄芩素液处理1h,其后换用0.75 mM H2O2处理。

因线粒体超微结构和膜电位对氧化应激较为敏感，所以线粒体超微结构观察实验和线粒体膜电位检测实验在24 h收取标本，其他实验分别在24 h、48 h收取标本。

1.2.3 线粒体超微结构观察 细胞常规消化，将1培养瓶(25 cm2)细胞收集至10 mL离心管中，1000 g离心5 min，弃上清，重悬，将细胞悬液移入0.5 mL EP管中，2000 g离心8 min，小心抽去上清液，加2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h。固定好的标本交由第四军医大学解剖学教研室电镜中心制作透射电镜切片，透射电镜下观察。

1.2.4 MTT法检测线粒体活性 具体步骤：a.向96孔板每孔中加入1×MTT溶液50 μL，另选取无细胞的4孔各加入150 μL DMSO作空白对照组；b.37 ℃，5 % CO2、100 %湿度孵育4 h；c.将96孔板置平板摇床上，室温，80 rpm振摇5 min；d.全自动酶标仪570 nm波长处检测光密度(OD)；e.线粒体活性率计算：每个检测值均减去本底(空白对照组)的平均值。线粒体活性率=处理组OD/对照组OD。

1.2.5 流式细胞术检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP) MMP检测方法：a.将Red cm ROS用254培养基按1∶5000稀释成工作液，避光保存；b.向培养细胞的六孔板每孔加入2 mL工作液，37℃孵育30 min；c.常规消化，收集细胞至离心管中，无菌生理盐水洗1次，离心，弃上清；d.向每管细胞中加入500 μL生理盐水重悬，移入流式管中，上流式细胞仪，选择PE通道，检测X-mean。

1.2.6 线粒体ATP产量变化检测 细胞常规消化，用254培养基重悬，使用细胞计数板计数，每组各取4500个细胞进行下一步实验；向细胞中加入2%三氯乙酸50 μL/管，室温静置10 min后向管中加入50 μL 4%三羟甲基氨基甲烷中和，1000 g离心3 min，取上清；使用ENLITEN®ATP检测试剂盒，用荧光素酶报告系统检测样品RLU值；使用试剂盒中ATP标准品配制梯度浓度的ATP溶液，检测梯度浓度ATP溶液各自的RLU值；按照ATP浓度梯度和所测得的RLU值，建立RLU值-ATP浓度的标准曲线，求得拟合公式；按照拟合公式和所测RLU值计算各样品ATP含量。

1.2.7 RT-PCR技术检测线粒体DNA拷贝数，观察线粒体生物合成情况 收集细胞，按照天根血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书操作步骤，提取全基因组DNA；分光光度计测DNA样品浓度；Real-time PCR法检测线粒体DNA拷贝数，选取线粒体DNA特征性基因ND4为检测目标，β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算对特异性扩增的目的基因进行相对定量。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行分析。采用one-way anova检验，各组数据两两比较，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素对氧化应激状态下PIG3V细胞线粒体结构的影响 线粒体超微结构观察显示，对照组和单纯黄芩素处理组细胞线粒体结构清晰、完整，线粒体嵴无肿胀，未见线粒体空泡化(图1a，1b)。氧化应激条件下PIG3V细胞部分线粒体出现空泡化改变，未空泡化的线粒体也出现了超微结构损害，如线粒体内膜肿胀、嵴增厚、嵴减少(图1c)。黄芩素预处理后的再予以氧化应激刺激PIG3V细胞中未见线粒体空泡化，线粒体结构清晰、完整，仅有部分线粒体嵴轻度肿胀(图1d)，较氧化应激组PIG3V线粒体超微结构损害明显减轻。可见黄芩素预处理后PIG3V细胞线粒体抗氧化应激能力增强，线粒体超微结构损害改善。

2.2 黄芩素对氧化应激状态下PIG3V细胞线粒体活性率的影响 处理后24 h氧化应激组线粒体活性率较对照组下降45.77%(P<0.05)，黄芩素预处理组较氧化应激组未见明显差异(P>0.05)。处理后48h时氧化应激组线粒体活性率较对照组下降40.67%(P<0.05)，而黄芩素预处理组较氧化应激组升高35.53%(P<0.05)。结果见图2a。

2.3 黄芩素对氧化应激状态下PIG3V细胞线粒体膜电位的影响 流式细胞术检测显示：氧化应激条件下PIG3V细胞膜电位较对照组下降26.93%(P<0.05)。黄芩素预处理组较氧化应激组升高37.54%(P<0.05)。结果见图2b。

2.4 黄芩素对氧化应激状态下PIG3V细胞线粒体ATP含量的影响 细胞内ATP含量处理后24 h各实验组差异无统计学意义。48 h时氧化应激组较对照组降低60.03%(P<0.05)，黄芩素预处理组较氧化应激组组升高210.4%(P<0.05)。结果见图2c。

2.5 黄芩素对氧化应激状态下PIG3V细胞线粒体DNA拷贝数的影响 处理后24 h，单纯黄芩素处理组线粒体DNA拷贝数较对照组升高340%(P<0.05),氧化应激组较对照组未见明显差异；黄芩素预处理组较氧化应激组升高113%(P<0.05)。48 h后单纯黄芩素处理组线粒体DNA拷贝数较对照组未见明显差异，氧化应激组线粒体DNA拷贝数较对照组下降75.33%(P<0.05)，而黄芩素预处理组较氧化应激组升高182.3%(P<0.05)。结果见图2d。

图1 黄芩素对氧化应激下PIG3V细胞线粒体超微结构的影响(a.对照组；b.单纯黄芩素组；c.氧化应激组；d.黄芩素预处理组。图中红色箭头所指为线粒体嵴，蓝色箭头所指为空泡化的线粒体)

图2 a：黄芩素对氧化应激下PIG3V细胞线粒体活性率的影响(n=3，*P<0.05)；b：黄芩素对氧化应激下PIG3V细胞线粒体的膜电位的影响(n=3，*P<0.05)；c：黄芩素对氧化应激下PIG3V细胞ATP含量的影响(n=3，*P<0.05)；d：黄芩素对氧化应激下PIG3V细胞线粒体DNA拷贝数的影响(n=3，*P<0.05)

3 讨论

线粒体是真核细胞“动力工厂”，它除了合成ATP之外，还具有多种重要的功能，包括产生ROS、调节氧化还原电位、细胞氧化还原信号转导、调控细胞凋亡和基因表达等。细胞中95%的ROS来源于线粒体，线粒体既是ROS产生的主要场所，又是ROS攻击的主要靶细胞器[4]。

氧化应激导致白癜风患者黑素细胞破坏，而氧化应激导致的线粒体损伤是黑素细胞破坏的重要原因，因为线粒体损伤诱导的线粒体凋亡途径是细胞凋亡主要途径之一。线粒体损伤后MMP下降，ATP产生减少，Cyt C释放至胞浆，形成Cyt C/Apaf-1/procaspase-3凋亡复合体，引起procaspase-3激活成caspase-3进而引起细胞的凋亡[5]。

本实验中用H2O2处理PIG3V细胞，结果显示线粒体超微结构损害，线粒体活性下降，MMP水平下降，ATP生产能力下降，提示线粒体功能障碍。而单独用黄芩素处理PIG3V细胞，线粒体活性、MMP、细胞ATP含量等指标与对照组比较未见明显差异。可见黄芩素直接提高PIG3V细胞线粒体功能的作用并不明显。黄芩素可能是通过间接途径提高线粒体功能的。本实验中H2O2可抑制细胞内的线粒体生物合成，降低细胞mtDNA拷贝数。而黄芩素单独作用于PIG3V细胞后24 h，即表现出对线粒体生物合成明显的促进作用，使线粒体DNA拷贝数明显增加，此作用在24 h时最明显，其后则逐渐减弱。我们推测黄芩素促进氧化应激下线粒体的生物合成，提高线粒体活性率、线粒体膜电位、ATP含量，抵消了氧化应激造成的线粒体数量损失和功能下降，是黄芩素改善氧化应激下线粒体功能障碍的可能机制。

有文献报道，在6-OHDA诱导的氧化应激模型中，黄芩素通过激活Keap1/Nrf2/HO-1通路保护PC12细胞[6]；在V79-4细胞造成氧化应激损伤模型中，黄芩素可激活 Nrf2通路，升高MnSOD蛋白表达水平，抵抗氧化应激对细胞的损伤[7]。我们课题组前期研究证实过表达Nrf2可以促进黑素细胞线粒体生物合成相关基因和蛋白(NRF1、TFAM)的表达，进而促进线粒体生物合成、上调线粒体功能相关的指标，改善白癜风患者黑素细胞的线粒体功能[8]。以上结果提示黄芩素可能是通过Nrf2-NRF1-TFAM途径促进线粒体生物合成，补充新的线粒体，抵消氧化应激造成的线粒体结构损害和功能下降，进而提高黑素细胞抗氧化能力。

[1] Prignano F, Pescitelli L, Becatti M, et al. Ultrastructural and functional alterations of mitochondria in perilesionalvitiligo skin[J]. J Dermatol Sci,2009,54(3):157-167.

[2] Liu B, Jian Z, Li Q, et al. Baicalein protects human melanocytes from H2O2-induced apoptosis via inhibiting mitochondria-dependent caspase activation and the p38 MAPK pathway[J]. Free Radic Biol Med,2012,53(2):183-193.

[3] 田军,朱龙飞,坚哲,等.过氧化氢诱导人黑素细胞氧化应激损伤模型的建立[J].实用皮肤性病学杂志,2014,7(6):406-410.

[4] Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species[J]. Biochem J,2009,417(1):1-13.

[5] Stevens JM. Cytochrome c as an experimental model protein[J]. Metallomics,2011,3(4):319-322.

[6] Zhang Z, Cui W, Li G, et al. Baicalein protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity through activation of Keap1/Nrf2/HO-1 and involving PKCalpha and PI3K/AKT signaling pathways[J]. J Agric Food Chem,2012,60(33):8171-8182.

[7] Lee IK, Kang KA, Zhang R, et al. Mitochondria protection of baicalein against oxidative damage via induction of manganese superoxide dismutase[J]. Environ Toxicol Pharmacol,2011,31(1):233-241.

[8] 朱龙飞,田军,坚哲,等.过表达Nrf2对白癜风黑素细胞线粒体生物合成和功能的影响[J].中华皮肤科杂志,2015,48(6):5-9.

(收稿：2016-09-07 修回：2016-12-14)

Effects of baicalein on the mitochondrial ultrastructure and function in stressed vitiligo melanocytes

ZHULongfei1,2TIANJun1,3,JIANZhe1,ZHANGWeigang1,LIUBangmin1,LIChunying1,GAOTianwen1.

1DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China; 2No.538HospitalofPLA,Hanzhong723000,Shaanxi,China; 3OutpatientDepartmentofNo.63600ArmyofPLA,Jiuquan732750,Gansu,China

GAOTianwen,E-mail：gaotw@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effects of baicalein (BE) on the mitochondrial ultrastructure and function in stressed vitiligo melanocytes. Methods: The vitiligo melanocyte line (PIG3V) cells were cultured in vitro, and then, were divided into the blank control group, baicalein group, H2O2group and baicalein+H2O2group. The ultrastructure changes of mitochondria were observed under electron microscope. The mitochondrial activity, mitochondrial membrane potential (MMP), level of intracellular ATP, copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) were detected by MTT, flow cytometry, ENLITEN ATP assay kit and real-time PCR (RT-PCR) respectively. Results: Compared with the H2O2group, the level of the damage of mitochondrial ultrastructure was lower and the level of mitochondrial activity, MMP, intracellular ATP, copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) were higher in the baicalein+H2O2group. Conclusion: BE protects the structure and function of mitochondria from the damage of oxidative stress and enhances the anti-oxidative ability of PIG3V cells.

baicalein; vitiligo; melanocyte; mitochondria; oxidative stress

国家自然科学基金资助项目(编号：81373844，81402599)

1第四军医大学西京皮肤医院，陕西西安，710032 2解放军第538医院，陕西汉中，723000 3解放军63600部队司令部门诊部，甘肃酒泉，732750

高天文，E-mail：gaotw@fmmu.edu.cn