miRNA在结肠癌中的潜在作用

魏业东　黄嬛　李明娟　蒋小红

摘 要：微小RNA（miRNA）是一段小型非编码RNA序列，它调控着某些编码细胞重要功能的基因的表达，比如细胞的增殖，分化和凋亡。某个特定的miRNA可能扮演着抑癌基因或者致癌基因的角色。这里，我们对miRNA在结肠癌中的潜在作用：作为结直肠癌早期诊断、预后和化疗敏感性预测标志物的影响作一综述。

关键词：结肠癌 miRNA 诊断 预后 化疗敏感性预测

在世界范围内，结直肠癌（colorectal cancer， CRC）在女性易发癌症中排名第三，在男性中排名第二。每年大约超过一百万人患结直肠癌并且超过五十万人死于结直肠癌。结直肠癌的发生率有很大差异，主要取决于生活习惯，环境和基因等方面[1]。流行病学的研究已经发现造成结直肠癌的危险因素，主要包括年龄，家族史，肠炎。同时，也发现了一些可预防的因素，例如肥胖，过度饮酒，过度食肉，高胆固醇的饮食，吸烟，较低的社会地位以及久坐的生活方式。

预后取决于诊断时的癌症分期。美国癌症联合会和国际抗癌联盟的肿瘤淋巴结转移（TNM）分期系统是目前首选的结直肠癌分期系统[2]。结直肠癌的早期发现会有90%的患者有5年生存期，相比于远端转移的发生，只有12%的患者有5年生存期。结直肠癌的早期症状并不明显，结直肠癌的诊断很大程度上依赖于筛查[1]。在过去的近20年里，筛选手段的引进包括内镜检查术，粪便潜血测试（fecal occult blood test， FOBT）和钡餐灌胃都改良了结直肠癌的早期诊断，在很多国家，结直肠癌的发生率和死亡率都呈现出了降低的趋势。不幸的是，只有不到40%的结直肠癌患者被及時诊断出了疾病。[3]另外，在接近50%的患者中，这种诊断是不够的。内镜检查术是有创伤的、昂贵的，而微创的、便宜的FOBT仅对47%-73%的患者敏感[1，2]，因此，开发准确的、微创的诊断和预后标志物是非常有必要的。

最近的研究发现微小RNA（miRNA）在结直肠癌的发展和治疗的过程中发挥着至关重要的作用。本文重点讲述miRNA在结直肠癌诊断和预后中的作用，以及在预测化疗敏感性中的作用。

一、miRNA概况

1993年，命名为lin-4的第一个miRNA在秀丽新小杆线虫中被发现。根据可检索到的在线数据库，2588个成熟的人类miRNAs已经被成功建立。miRNAs是小分子（18-25个核苷酸）RNA聚合物，miRNAs的前体表达后被蛋白Dicer切割后形成成熟的miRNA结构[4]。它们直接嵌入或者通过影响mRNA分子的转录来调控人类超过30%的基因，最终来调控蛋白质的翻译。miRNA可以通过融入RNA诱导的沉默复合体（RISC）和绑定一个靶标mRNA分子来完成它的调控。miRNA影响mRNA的机制主要是通过绑定mRNA，导致mRNA的降解或者抑制其转录。如果miRNA和mRNA之间存在准确的碱基互补配对，mRNA就被降解，反之，mRNA就被沉默。其他的机制包括直接绑定DNA，表观遗传学中的甲基化，以及靶向mRNA绑定蛋白质。一个单链的miRNA可以影响很多mRNA，然而一个单链的mRNA可以被很多miRNA影响 。

miRNA的作用是依赖于mRNA的功能并且二者相互作用的。因此，miRNA具有某些高级功能，比如减少肿瘤抑制剂的表达，促进细胞增殖和肿瘤形成。miRNA在肿瘤抑制功能上的减弱可能促进了肿瘤的形成。其他miRNA调控着细胞增殖和侵袭以及促进转移。微小RNA的基因通常位于特定的基因组，这些基因组对于杂合性和扩增性的丢失异常敏感。自从人类发现miRNA和细胞的分化，凋亡以及增殖密切相关后，人们越来越多地关注miRNA与人类疾病的关系，比如结直肠癌。

二、miRNA与早期诊断

当结直肠癌在最早期阶段被诊断出来，患者就能接收到最成功的治疗，尤其是诊断出结直肠癌并且在发生转移之前，手术切除被认为是唯一有效的治疗手段。对诊断早期结直肠癌最广泛的方法是FOBT和结肠镜检查。尽管这些试验已经提高了结直肠癌的生存率，但是FOBT敏感性较低且结肠镜费用昂贵、创伤大。另外，某些食物和药物会导致FOBT的假阳性结果。近几年的研究已经表明，miRNA和结直肠癌之间存在着相关性。大量相关工作已经显示miRNA可以作为结直肠癌早期诊断可靠的、无创的、高敏感性的生物标志物。

胃肠道溃疡时可观察到炎性细胞连续不断地释放到肠腔内，并且可以在粪便中检测到。第一次在粪便中检测miRNA的研究结果显示结直肠癌患者的粪便中有高表达的miRNA，这个数据证明病人肿瘤组织样本与miRNA有明显的相关性  。Ahmed等人最近研究了来自不同结直肠癌老鼠模型的肿瘤组织样本，发现miR-135b涉及到一个复杂的反馈回路。分子通路的突变通常发生在涉及APC和PTEN/PI3K的结直肠癌中，这种突变会促进miR-135b的过表达，并且它本身会促进肿瘤的发生和进展。另外一个研究发现miR-135b在结直肠癌中表达量上升，而且癌旁组织和正常组织比也上升了。肠炎病人和健康对照组相比，用粪便样品发现从腺瘤到癌miR-135b有增加的趋势。同时发现手术切除结直肠癌或晚期腺瘤后粪便中的miR-135b含量显著下降。粪便中miR-135b的敏感度在不同组织中是不同的，在结直肠癌中是78%，在晚期腺瘤中是73%，在普通腺瘤中是65%;这种特异性占68% 。

Koga等人发现粪便中miR-106a在提高FOBT敏感性方面也是很有意义的。他们从FOBT残渣中提取粪便中的RNA去分析潜在的miRNA标志物，发现粪便中miR-106a的敏感性和特异性分别是34.2%和97.2%，而FOBT的特异性和敏感性分别是60.7%和98.1%。重要的是，粪便中miR-106a对FOBT结果的分析显示敏感度和特异度分别是70.9%和96.3%。四分之一的假阴性的结直肠癌患者通过增加粪便中miR-106a分析后发现是真阳性，也就是说粪便中miR-106a分析大大加强了筛查试验的敏感性。Koga等人通过他们的早期研究验证了对FOBT残渣的使用，他们发现FOBT残渣在4℃放了5天后和之前相比分离的miR-106a的质量和数量并没有太大差异。

目前应用最多的结直肠癌血清标志物是癌胚抗原（CEA），但是在其他一些非癌环境中也检测到它的表达量上升了，例如在肠炎，肝炎，肺炎和胰腺炎中。研究人员发现在血清和血浆中有miRNA的存在。它们被包裹在微泡和外泌体中，因此免疫了核糖核酸酶的降解 。它们在各种其他环境中也是稳定的，比如低/高 PH ，反复冻融，还有长期存储。

在很多最近的研究中，研究人员发现结直肠癌病人和健康人相比血浆中某些特殊的miRNA不是上调就是下调，同时它们对于诊断结直肠癌和腺瘤的作用也被发现。Kanaan等人 把8个血浆miRNA分为一组，另外3个血浆miRNA分为一组，以此精确地区分患有结直肠腺瘤的病人和不含结直肠腺瘤的病人。他们通过miRNA能够从所有的结直肠癌分型中分清患有结直肠腺瘤的病人。Yong等人也发现了一组miRNA，其中含有3个miRNA，它们在结直肠癌患者中的表达量也上升了，这跟它们在各自结直肠癌组织样本中的表达量有关。他们也解释说，与对照组病人相比结直肠癌患者从早期到晚期这些miRNA在血浆中有一个上升趋势。更进一步说，作为结直肠癌诊断的标志物，这3个miRNA具有80%的敏感度和84.4%的特异度。另外的20个miRNA不是上调就是下调，通过它们在血清水平的变化可以准确区分Ⅳ期结直肠癌患者和对照组病人。随后的研究导致了最小二乘回归模式的发展，它能够基于Ⅳ期结直肠癌患者血清中的miRNA来准确分析病人处于Ⅰ期还是Ⅱ期 。Luo等人证明了9种血清中miRNA区分结直肠癌患者和对照组病人的作用。Gopalan等人发现miR-1288不仅和肿瘤的分期有关，還和胃肠道的位置有关;距离结肠位置越远miR-1288的表达量越高。

在结直肠癌患者血清中miRNA的研究中，稳定可靠的对照组对于实验数据的准确性是至关重要的。Hu等人发现miR-1228在不同类型的癌症病人中是稳定表达的，其中包括结直肠癌以及结直肠癌的不同分期。因此，他们建议miR-1228是研究结直肠癌中miRNA最稳定的内参。

三、miRNA和预后

尽管结直肠癌的早期诊断使疾病的死亡率得到了降低，但是当患者被频繁地诊断为晚期的时候人们发现结直肠癌的预后是比较差的。目前对于结直肠癌的管理依赖于临床和病理学因素，其中包括肿瘤的大小（T），淋巴结的扩散范围（N），是否发生转移（M），或者TNM分期，肿瘤边缘，分化程度，淋巴管侵袭。越来越多的证据显示分子标志物在评价预后和临床治疗上有着重要意义。很多研究论证了miRNA作为分子标志物的作用。

第一个建立miRNA和结直肠癌关系的研究发现miRNA-200c和生存率之间存在着关联。迄今为止，多项研究显示无论miRNA的减少还是增加都和预后较差相关。Toiyama等人的研究发现Ⅳ期结直肠癌患者与Ⅰ-Ⅲ期结直肠癌患者相比，血清中miR-200c的含量有所增加，进一步发现miR-200c可以作为淋巴结转移和复发的预测因子。miR-200c也被发现可以作为结直肠癌独立的预后指示器。另外一个研究也发现结直肠癌患者与正常人相比血清中的miR-200c含量是上升的 。手术切除的结直肠癌患者和化疗的结直肠癌患者血清中miR-200c的含量也进行了比较。具有良好预后的结直肠癌患者血清中miR-200c含量恢复到了正常水平，而结直肠癌复发或者转移的患者血清中miR-200c的含量仍然较高或者是短暂降低后又很快升高。Hur等人[16]发现肝转移瘤中miR-200c的含量比原发瘤要高。

另外一个可能成为预后标志物的miRNA是miR-21。在6种不同的癌症中，miR-21出现了上调，当然这其中就包括结直肠癌。以前的研究显示miR-21高表达的肿瘤组织样本是与淋巴结和远端转移有关的;它也和结直肠癌的临床分期有关。另有研究发现结直肠癌患者血清中miR-21的含量是上升的 。另外，通过血清中miR-21可以精确地区分健康对照组的腺瘤和结直肠癌患者的恶性肿瘤。血清中上调的miR-21也跟肿瘤大小，远端转移，生存质量有关，可以单独作为结直肠癌预后的标志物。Schetter等人基于一个84个美国结直肠癌患者的群体和一个113个中国结直肠癌患者的群体得出，miR-21表达量上升和结直肠癌预后有明显的关系。miR-21表达量上升必然有一个糟糕的预后，并且对于癌症分期和临床结果是独立的。随后的研究是针对不同种族的病人，结果发现miR-21可以作为一种预后生物标志物，而且是不分种族的。

Kjaer-Frifeldt等人在Ⅱ期结直肠癌病人中针对miR-21能否作为预后指示器使用做了另外一项群体研究。作者认为miR-21可以和分期分型的传统手段相结合。他们的观点是miR-21高表达的病人更容易从辅助化疗中获益。然而，Oue等人发现，在一个Ⅱ期结直肠癌的日本患者群体中，miR-21的高表达和较差的辅助化疗相关。笔者认为并不是miR-21的低表达就意味着辅助化疗效果好。

很多其他miRNA相继被发现也是潜在的预后生物标志物。以下的miRNA，至少有一项研究发现它们是和预后相关的：miR-378 ，miR-126 ，miR-224 ，miR-429 ，miR-182[31]，miR-32 ， miR-214 ，miR-182 ，miR-92a ，miR-124，miR-30b，miR-625 ，miR-155和miR-210 ，miR-215 ，miR-130b ， miR-148 和miR-16 。RNAⅢ核酸内切酶中以Dicer最为出名，它参与miRNA的形成，并且它的表达是和预后差相关的 。Iliou等人发现，Dicer功能的损伤导致了调控CD44和上皮间质转换的miRNA下调。笔者也发现这种改变加强了肿瘤的发生和肝转移。

四、miRNA和化疗敏感性

除了作为诊断和预后的生物标志物之外，有研究已经发现miRNA可以作为结直肠癌对化疗敏感性的标志物。病人对化疗的反应是不同的，其中的机制非常复杂，目前并没有阐述清楚。miRNA对于化疗敏感性的预测可以使结直肠癌患者得到更加个性化的治疗。

以前的研究已经发现miR-21的表达是和预后差以及5-氟尿嘧啶的治疗反应有关。这也就意味着miR-21的表达量的上升和5-氟尿嘧啶有着密切的关系。5-氟尿嘧啶治疗结直肠癌促使肿瘤细胞中miR-21的含量上升，或许这是克服药物细胞毒性的一种方式。最近，Deng等人发现，在结直肠癌细胞中miR-21的被迫过表达增加了5-氟尿嘧啶的耐药性，随着miR-21的敲除这种作用被反转了。这也同时证明了姜黄素和二氟姜黄素（CDF）逆转5-氟尿嘧啶和奥沙利铂联合用药治疗结直肠癌耐药 。有研究显示，当细胞被5-氟尿嘧啶和奥沙利铂处理时，CDF可以抑制细胞的生长，同时发现miR-21的下调。笔者认为CDF导致了miR-21表达量的下降继而增加了5-氟尿嘧啶和奥沙利铂治疗的敏感性。

另有研究已经发现其他miRNA的表达与化疗试剂敏感性有关。例如，miR-153的上调与增加奥沙利铂和顺铂在体内、体外的耐药性有关。另外，miR-19a在晚期耐药结直肠癌患者血清中上调，利用这一点可以区分对奥沙利铂耐药的病人和敏感的病人。Kjersem等人[51]发现了3个miRNA（miR106a，miR-130b，miR-484），它们的上调与5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的耐药有关。有趣的是，耐药性的产生与无进展生存期和总生存率无关。

其他miRNA的下调也与化疗耐药相关。在与正常标本比较的过程中发现，miR-129[52]和miR-15b与结直肠癌对5-氟尿嘧啶耐药有关。miR-129转染进入细胞增强了5-氟尿嘧啶的细胞毒性。miR-1915在多药耐药中也是至关重要的。在多种癌细胞中，Bcl-2的过表达已经被普遍认为是耐药性产生的标志，包括结直肠癌。Xu等人发现在多药耐药的结直肠癌细胞中伴随着miR-1915的下调和Bcl-2的过表达。通过转染miR-1915，他们发现miR-1915表达量的增加导致了Bcl-2蛋白水平的减少，进一步通过调控凋亡通路敏感化细胞对多种药物的治疗。

He等人[55]最近的研究论证了miRNA对“瓦博格效应”和化疗耐药的影响。“瓦博格效应”就是指人们观察到，相比于正常细胞，癌细胞利用糖酵解比利用氧化磷酸化更多。研究发现miR-122直接靶向于糖酵解酶丙酮酸酯激酶M2（PKM2），因此，miR-122可以增强5-氟尿嘧啶在结直肠癌细胞中的耐药性。5-氟尿嘧啶的耐药是和糖酵解糖代谢的增加有关的，这个过程是通過葡萄糖消耗的增加，乳酸释放和PKM2，乳酸脱氢酶，GLUT-1葡萄糖转录因子表达量增加。有意思的是，miR-122的过表达抑制PKM2，显著提高了5-氟尿嘧啶在耐药细胞中的细胞毒性。

五、结语和展望

miRNA的发现在科学界引起了巨大反响并且miRNA在结直肠癌领域的机制研究仍在继续。无疑，miRNA在结直肠癌发生发展过程中都起了重要作用。很多研究报道miRNA与肿瘤的诊断，预后和化疗敏感性都有着密切关系。研究显示，miRNA可以作为结直肠癌早期诊断的标志物及在结直肠癌各个阶段的指导用药。进一步的研究必然会验证这些发现，最重要的是，确定这些结论是否能够为临床治疗提供有效的信息。另外，研究发现miRNA具有潜在的治疗作用。未来更多的研究将会探索miRNA对结直肠癌的治疗策略，例如miRNA传递进入细胞的机制，加强miRNA与mRNA的绑定和内源性miRNA的绑定。未来的研究必然会更透彻的理解miRNA的生物学机制，提高miRNA在结直肠癌诊断，预后和化疗敏感性上的精确度。

参考文献

[1] Kanaan Z， Rai SN， Eichenberger MR， et al. Plasma miR-21： a potential diagnostic marker of colorectal cancer. Ann Surg 2012; 256： 544-551.

[2] Burch JA， Soares-Weiser K， St John DJ， et al. Diagnostic accuracy of faecal occult blood tests used in screening for colorectal cancer： a  systematic review. J Med Screen 2007; 14： 132-137 .

[3] Ciafrè SA， Galardi S. microRNAs and RNA-binding proteins： a complex network of  interactions and reciprocal regulations in cancer. RNA Biol 2013; 10： 935-942.

[4] Ahmed FE， Jeffries CD， Vos PW， et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics Proteomics 2009; 6： 281-295.

作者简介

魏业东（1991.7—），男，籍贯，山东省淄博市，研究生在读，研究方向：肿瘤药理学。

通讯作者

蒋小红（1976.12—），女，籍贯，浙江省嘉兴市，本科，医学实验中心主任，高级实验师，研究方向：肿瘤药理学。