豆粕中粗蛋白含量测定的不确定度评定

张美玲

摘要按照《饲料中粗蛋白测定方法》GB/T 6432—1994标准测定豆粕中粗蛋白的含量，通过计算测量过程中的系统因素和随机因素导致的不确定度，最终来评定豆粕中粗蛋白测定的不确定度。

关键词豆粕；粗蛋白；不确定度

中图分类号S816文献标识码A文章编号0517-6611（2017）26-0109-04

Evaluation of Uncertainty in Determination of Crude Protein in Soybean Meal

ZHANG Meiling

（China Certification & Inspection Group Shandong Test Co.，Ltd.， Qingdao，Shandong 266032）

AbstractThe content of crude protein in soybean meal was determined according to Determination Method of Crude Protein in Forage GB/T 6432—1994， and the uncertainty caused by random factors and system factors in the process of measurement was calculated，and the uncertainty of crude protein in soybean meal was finally evaluated.

Key wordsSoybean meal；Protein；Uncertainty

豆粕是食用油生产链下游产品，常被用于生产饲料，是一种营养价值全面的原料。豆粕品质评价指标有很多，其中最重要的就是粗蛋白含量。对豆粕中所含蛋白含量的检测结果进行不确定度评定，既可以满足实验室对检测结果进行不确定度评定[1]的能力要求，又可以在不确定度影响到对限度符合性判断时进行检测结果的不确定度判定。尤其是当检测值处于标准的临界值时，计算不确定度一方面能检查检测工作是否存在差错，另一方面也能减轻检测人员和检测机构的风险，更利于检测结论的判定。

测定豆粕中的粗蛋白含量大多采用凯氏定氮法。凯氏定氮法的原理[2]如下：使用强酸硫酸破坏有机物，加入催化剂，样品中的含氮物被转化为硫酸铵，使用强碱蒸馏使氨气逸出，硼酸来吸收氨气，吸收液被酸滴定，测出样品的含氮量，乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。笔者按照《饲料中粗蛋白测定方法》GB/T 6432—1994标准测定豆粕中粗蛋白含量，通过计算测定过程中的系统因素和随机因素导致的不确定度，最终来评定豆粕中粗蛋白测定的不确定度。

1試剂与仪器设备

1.1试剂

硫酸、硫酸铜、硫酸钾、40%氢氧化钠溶液、甲基红、2%硼酸溶液、溴甲酚绿混合指示剂、盐酸、蔗糖，均为分析纯。

1.2仪器设备

样品筛（0.5 mm）；多功能粉碎机；50 mL酸式滴定管；电子天平（感量0.000 1 g）；250 mL锥形瓶；消煮炉；300mL消化管；自动凯氏定氮仪。

2测定步骤与测定结果

2.1测定步骤

2.1.1消煮样品。称取0.5 g豆粕样品（精确至0.000 2 g）放入消化管中；加入混合催化剂（0.4 g硫酸铜、6 g硫酸钾），加入硫酸12 mL，将消化管放到消化炉上消煮。先慢火，样品小火焦化后，泡沫开始消失，再调高炉子温度，分2个梯度升高到420 ℃，在420 ℃下消化1 h以上，直到消化液的颜色呈现透明的蓝绿色，取出消化管，放在架子上冷却，再加入30 mL蒸馏水。

2.1.2蒸馏氨。自动定氮仪按照作业程序操作，将消化好的消化管放到蒸馏装置上，锥形瓶中加入25 mL硼酸作为吸收液，加入混合指示剂2滴，向消煮管中加入50 mL氢氧化钠溶液，蒸馏5 min，吸收液体积在120 mL左右，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，收集冲洗液，卸下锥形瓶。

2.1.3滴定。将吸收液用0.1 mol/L的盐酸溶液滴定，滴定终点是蓝绿色的试液变成灰红色。

2.1.4测定空白。不称量样品，只称量蔗糖0.5 g，其他步骤同豆粕样品的操作步骤一致，消耗约0.2 mL 0.1 mol/L鹽酸标准溶液，否则，查找原因，重新补测。

2.2测定结果

取待测样品豆粕，分别独立操作8次，检测结果见表1。

3数学模型建立及不确定度来源分析

3.1数学模型建立

w（%）=（V-V0）×C×0.014 0×6.25×100/m（1）

式中，w为测得的粗蛋白含量（%）；

V为滴定试样时所需标准酸溶液体积（mL）；

V0为滴定空白时所需标准酸溶液体积（mL）；

C为盐酸标准溶液浓度（mol/L）；

m为试样质量（g）；

0.014 0为每毫克当量氮的克数；

6.25为氮与蛋白质换算的平均系数。

3.2不确定度分析来源

①盐酸标准溶液的浓度；

②样品的制备过程；

③样品中粗蛋白含量的测定；

④A类不确定度——重复性测量带来的不确定度。

4不确定度分量计算

4.1盐酸标准溶液浓度的不确定度

4.1.1数学模型的建立。

按照实验室标准溶液程序配制盐酸标准溶液，2个人对其浓度进行标定，列出数学公式：

c（HCl）=m×w0×2×1 000/（V1-V2）×M（2）

式中，c（HCl）表示标准盐酸溶液的浓度（mol/L）；

m表示基准物质无水碳酸钠的质量（g）；

V1表示盐酸标准溶液滴定量（mL）；

V2表示空白消耗盐酸标准溶液的量（mL）；

w0表示基准物质无水碳酸钠纯度（g/g）；

1 000为换算系数，由mL转化为L；

2为Na+参加反应的个数；M表示基准物质无水碳酸钠的摩尔质量，为105.988 g/mol。

4.1.2不确定度的来源分析。

盐酸标准溶液的浓度主要有5个不确定度来源[3]，包括重复性测量、无水碳酸钠的称重、碳酸钠的摩尔质量、滴定体积、最终浓度的数值修约。

4.1.3计算不确定度。

4.1.3.12人重复性标定盐酸产生的标准不确定度。

用精密天平称量0.2 g无水碳酸钠，置于270～300 ℃高温炉中灼烧2 h，加入50 mL水溶解，加入甲基红-溴甲酚绿指示剂5滴，用配制的盐酸溶液滴定碳酸钠，溶液由绿色变为暗红色，即为滴定终点，2 min内煮沸，用凉水立即冷却，继续滴定至溶液再度呈现暗红色。同时，测定2个空白。2人标定盐酸标准溶液的结果见表2。

表2中的计算结果属于A类重复性测量不确定度[4]。计算单次测量的标准差采用贝塞尔公式计算（n=8），

则：u（x）=Sx=sn=9.91×10-5（mol/L），μ（x）=n-1=7。

4.1.3.2基准物质无水碳酸钠带入的标准不确定度。

4.1.3.2.1试剂纯度引入的标准不确定度u（p）。

基準碳物质酸钠的纯度为（100.00±0.05）%，可认同为矩形分布（K=3），μ=∞。

u（p）=0.000 5/K=0.000 5/=0.000 288 7（g），μ（p）=∞

相对标准不确定度（%）=u（p）p=u（p）100%=0.000 288 7

4.1.3.2.2称量带入的标准不确定度u（m）[5]。

干燥器与天平称量仓内均放置同质硅胶，可认为湿度相同，称量时不会吸潮。天平称量允差为±0.1 mg（查阅电子天平检定证书）；视为矩形分布（K=3），μ=∞。

u（m）=0.000 1/K=5.77×10-5（g），μ（m）=∞

相对标准不确定度（%）=u（m）m=u（m）0.199 8=2.89×10-4

4.1.3.2.3基准物质无水碳酸钠的摩尔质量带入的标准不确定度。

基准无水碳酸钠摩尔质量产生的标准不确定度不大，可以忽略。

4.1.3.2.4滴定体积带入的标准不确定度u（v）。

（1）滴定管校准带入的标准不确定度。

50 mL酸式滴定管（A级），相对允许误差为±0.05 mL（查阅校准证书），按照矩形分布（K=3），μ=∞。

u（V1）= u1（V2）=0.05/K=0.028 9 mL，μ（v）=∞

（2）温度变化引入的标准不确定度u（v1）。

试验在控温设备条件下进行，设室温变化范围为（20±3）℃。滴定管的体积变化小于液体体积变化，V1=37.64 mL，V2=0.02 mL，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃，依照矩形分布（K=3），μ=∞。

u2（V1）=3×2.1×10-4×V/K=3×2.1×10-4×37.64/3=0.013 7（mL），μ（v1）=∞

u2（V2）=3×2.1×10-4×V/K=3×2.1×10-4×0.02/3=7.27×10-5（mL），μ（v2）=∞

（3）滴定体积合成不确定度分量。

u（V1）2=u1（V1）2+u2（V1）2，u（V1）=0.028 92+0.013 72=3.20×10-2（mL）

u（V2）2=u1（V2）2+u2（V2）2，u（V2）=0.028 92+0.000 007 272=2.90×10-2（mL）

u（V1-V2）=0.0322+0.0292=4.32×10-2（mL）

相对标准不确定度（%）=u（v1-v2）v1-v2=u（v1-v2）37.64-0.02= 1.15×10-3

4.1.3.3盐酸标准溶液浓度的数值修带入的标准不确定度。

2人进行试验，每人做4个平行，测定的盐酸标准溶液的平均浓度值为0.100 2 mol/L，按照均匀分布处理，K=3，属于 B类评定，因此其标准溶液浓度的修约的标准不确定度 u（r）为：

u（r）=aK=0.000 1/23=2.89×10-5 （mol/L）

相对标准不确定度（%）=u（r）c=2.88×10-4

4.1.3.4盐酸标准溶液的不确定度。

盐酸标准溶液的不确定度分量分析结果见表3。

4.1.3.5盐酸标准溶液浓度平均值的B类相对合成标准不确定度的计算。

标定体积、测量的重复性、基准试剂无水碳酸钠质量等不确定度相互独立，故应将上述数据合成，得到盐酸的相对合成标准不确定度：

UB（c）=[u（m）m]2+[u（p）p]2+[u（v1-v2）v1-v2]2+[u（r）r]2=

1.25×10-3

4.1.3.6鹽酸标准溶液浓度平均值的不确定度U（c）（A类+B类）。

盐酸标准溶液浓度平均值的不确定度U（c）为：

U（c）= uA（c）2+uB（c）2=

0.000 9912×0.100 22+0.001 252×0.100 2=

0.000 159 8（mol/L）

盐酸标准溶液浓度的相对不确定度为：

U（c）rep=0.000 159 8/0.100 2=0.001 6

4.2样品制备不确定度的评定

试验采用的样品经粉碎机粉碎后，过0.5 mm的筛网，再次混合均匀，取样。因此，样品不均匀产生的不确定度，可以忽略。

4.3样品中粗蛋白含量测定不确定度的评定

4.3.1样品称量的不确定度。

称量所用精密天平（万分之一），型号为AB-204N；

电子天平检定证书中天平称量允许误差为±0.1 mg；视为矩形分布（k=3），进行B类不确定度评定，其标准不确定度为：

u（mr）=0.000 13=5.774×10-5

则称量的相对不确定度为：

ur（mr）= u（mr）/0.503 2=0.000 114 7

4.3.2滴定的不确定度评定。

4.3.2.1

50 mL酸式滴定管带入的不确定度。

50 mL酸式滴定管，按照矩形分布（k=3），按照检定规程，相对允许误差为±0.05 mL，对其进行B类不确定度的评定，其标准不确定度：

u（Vr）=0.053=0.028 87

则消耗盐酸体积的相对标准不确定度为：

ur（Vr）= u（Vr）/27.22=0.001 061

4.3.2.2温度对滴定结果的不确定度影响。

滴定室实际测定温度为（20±3）℃，滴定管的体积变化小于液体体积变化，Va=27.22 mL，Va0=0.10 mL，水的膨胀系数为2.1×10-4℃，单位体积产生的变化为±（1×2.1×10-4×3）mL=6.3×10-4 mL。

u（V）=27.22×6.3×10-4 mL/3=0.009 901 mL

u0（V0）=0.10×6.3×10-4mL/3=0.000 036 37 mL

合成滴定体积的不确定度分量：

u（V）2= u（Vr）2+ u（V）2

u（V）=0.030 5（mL）

u（V0）2= u（Vr）2+ u0（V0）2

u（V0）=0.028 9（mL）

温度对滴定结果产生的标准不确定度为：

u（V-V0）2=u（V）2+u（V0）2

u（V-V0）= 0.042 0（mL）

则相对标准不确定度=0.042 027.22-0.10=0.001 549

4.3.2.3滴定终点对滴定结果的不确定度影响。

该试验中判断终点的指示剂是甲基红-溴甲酚绿。在滴定过程中，滴定终点为灰红色，pH为4.2～6.3。研究表明，实际滴定时会多消耗一定量的标准滴定液，其不确定度为0.004 mL，肉眼判断终点滞后，不确定度为0.03 mL。此次滴定平均消耗盐酸标准溶液27.22 mL。

合成不确定度为：

u（Dr）=0.0042+0.032=0.030 27（mL）

相对合成不确定度为：

ur（Dr）= u（Dr）/27.22=0.001 112

4.3.2.4滴定的合成標准不确定度[6]。

u=u（Vr）2+u（V-V0）2+u（Dr）2=

0.028 872+0.042 02+0.030 272=0.059 28 mL

4.3.2.5滴定的相对合成标准不确定度。

u3=u/27.22=0.002 178

4.4重复性检测结果带来的不确定度评定

在一致条件下，测定了8次豆粕中的粗蛋白含量，结果见表1，粗蛋白含量测定结果为47.25%。

测定结果的标准不确定度为：

s=ni=1（wi-）2n-1=0.183 7

u（xi）=sn=0.064 95

测定结果的的相对标准不确定度为：

u（x）= u（xi）/47.25=0.001 375

4.5不确定度分量计算

不确定度分量计算结果见表4。

5结语

建立数学等式，计算系统因素和随机因素和带入的测量不确定度分量，找出豆粕粗蛋白测定的不确定度分量主要来源于4个分量：包括重复性测量的A类评定、天平称重、消耗标准溶液的体积和标准溶液浓度的B类评定，通过数值大小比较得出标准溶液浓度影响最大，分量滴定标准溶液体积次之。因此，在标定盐酸标准溶液时，称量基准工作试剂的质量小于等于0.5 g时，要用十万分之一分析天平，需2人进行试验，每人分别做4个平行，其标定结果的相对极差不得大于相对重复性临界极差，8个平行标定结果的相对极差不得大于相对重复性临界极差。盐酸标准滴定溶液的温度不是20 ℃时，应对标准滴定溶液体积进行补正。在实际工作中，要注意以上关键操作点，降低检测过程中产生的不确定度值。

参考文献

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