夏枯草提取物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究

2017-06-10李旎郑溢陈魏陈良华林河通

热带作物学报 2017年12期

李旎郑溢陈魏陈良华林河通

摘要在体外模拟人体胃液条件下，采用分光光度法测定了夏枯草水提取物、醇提取物对亚硝酸盐的清除率以及对亚硝胺合成的阻断率，并与常用抗氧化剂维生素C进行比较。结果表明：随反应质量浓度的提高、作用时间的延长，夏枯草提取物对亚硝酸钠的清除能力和阻断亚硝胺合成能力有明显提高。根据不同作用时间的清除效果及阻断亚硝胺合成效果的对比，可以得知，120 min为较佳的作用时间。通过与维生素C比较分析得出，夏枯草提取物具有较强的亚硝酸钠清除能力和阻断亚硝胺合成的能力。

关键词夏枯草；提取物；亚硝酸盐清除；亚硝胺合成阻断

中图分类号 TS202.1 文献标识码 A

Abstract The scavenging rate of nitrite and the blocking rate of nitrosamine synthesis by alcohol extract and water extract of Prunella vulgaris L. were measured by spectrophotometry in vitro and compared with the common antioxidant， vitamin C. The results showed that the nitrite scavenging ability and nitrosamine synthesis blocking ability of the extracts of P. vulgaris were significantly improved with the increase of concentration and time. According to the comparison of scavenging rate of nitrite and the blocking rate of nitrosamine synthesis with different time，the optimum reaction time was 120 min. Through the comparison and analysis with vitamin C， it was concluded that P. vulgaris extracts had a strong ability to scavenge nitrite and block nitrosamine synthesis.

Key words Prunella vulgaris L.； extracts； nitrite scavenging； blocking nitrosamine synthesis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.027

亚硝胺能够促使人体内多种器官产生恶性肿瘤，属于较强致癌物，危害人体健康[1]。亚硝酸盐作为亚硝胺的前体物质，不仅广泛存在于食物中，也可通过在人体胃内酸性环境下发生亚硝化反应形成[2]，从而增加人体罹患多种癌症的风险[3-4]。故利用食品中的活性成分清除亚硝胺类化合物，从而减轻其对人体的危害，已成为食品安全领域的研究热点[5]。

根据之前的研究显示，黑麦中的多酚类物质[6]、总黄酮[7]、精油类物质[8-10]以及槲皮素[11]等天然活性成分，具有良好的亚硝酸盐清除和阻断亚硝胺合成的效果。夏枯草（Prunella vulgaris L.）是一种药食同源的多年生草本植物，为唇形科（Lamiaceae）夏枯草屬夏枯草植物的干燥果穗。现代药理学研究证实，夏枯草具有抗病毒[12]、免疫抑制活性[13]、抗氧化和清除自由基[14]、抗肿瘤[15]等生物活性。鉴于夏枯草的较好的抗氧化效果，推测夏枯草可能具有亚硝酸盐清除作用及亚硝胺合成阻断作用，但目前尚未见相关研究报道。故本研究在体外模拟人体胃液体系中，研究夏枯草提取物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的作用，为夏枯草产品的开发及应用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料夏枯草采购自厦门市同仁堂药店。对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、α-萘胺、二甲胺、二甲基亚砜等试剂均为国产分析纯化学试剂。

1.1.2 仪器与设备 Cary50紫外-可见分光光度计，美国瓦里安有限公司；UJ1434001型水浴锅，英国Grant公司；Eyela N-1200BV-WD型旋转蒸发仪，上海东京理化器械公司。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草醇提取物的制备夏枯草去杂，磨成粉末，过80目筛。以95%乙醇为溶剂，在50 ℃条件下超声浸提20 min，提取滤液，对滤渣反复以上步骤3次，料液比分别为1 ∶ 15、1 ∶ 9、1 ∶ 6（g/mL），合并滤液，经活性炭脱色处理，减压过滤，旋转蒸发浓缩至浸膏，真空冷冻干燥得夏枯草醇提取物粉末，用二甲基亚砜溶液溶解稀释至梯度浓度，备用。

1.2.2 夏枯草水提取物的制备夏枯草去杂，磨成粉末，过80目筛。以蒸馏水为溶剂，在50 ℃条件下超声浸提20 min，提取滤液，对滤渣反复以上步骤3次，料液比分别为1 ∶ 15、1 ∶ 9、1 ∶ 6（g/mL），合并滤液，95%乙醇沉淀去除杂质，过滤取上清液，旋转蒸发浓缩至浸膏，真空冷冻干燥即得夏枯草水提取物粉末，用蒸馏水溶解稀释至梯度浓度，备用。

1.2.3 模拟胃液的制备称取胃蛋白酶3.2 g，NaCl 2.0 g，蒸馏水溶解，定容至1 000 mL，盐酸调节pH值至3.0。

1.2.4 夏枯草提取物对亚硝盐清除率的测定参考盛玮等[16]的方法测定亚硝盐清除率，略有修改。分别取不同浓度的样液2.0 mL，加入4.0 mL柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液，再加入0.5 mL 1.0 mmol/L NaNO2标准溶液，于37 ℃水浴，根据时间梯度，分别于30、60、120、180 min取出，加入1.0 mL 0.4%对氨基苯磺酸，静置5 min，加0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，静置15 min。540 nm波长下测样品吸光度As，蒸馏水代替NaNO2标准溶液作为空白对照，测其吸光度值Ao，以蒸馏水代替样品溶液测出样液本底吸光度值Ab，计算清除率S=[Ao-（As-Ab）]/Ao×100%。平行重复3次，并求平均值。

1.2.5 夏枯草提取物亞硝胺合成阻断率的测定

夏枯草对亚硝胺合成阻断率的测定参考傅茂润等[17]和郭艳华等[18]方法，略有修改。分别取不同浓度样液0.4 mL，加入2 mL柠檬酸钠-盐酸缓冲液，0.2 mL 1 mmol/L NaNO2溶液，0.2 mL 1 mmol/L二甲胺溶液，加入2.4 mL蒸馏水，于37 ℃的恒温水浴，根据时间梯度，分别于30、60、120、180 min时刻，移取1.0 mL反应液，加入0.5 mL 0.5% Na2CO3溶液，于254 nm波长紫外灯下，照射处理15 min后，加入1.5 mL 1%的对氨基苯磺酸、1.5 mL 0.1%的α-萘胺、0.5 mL蒸馏水，静置15 min。525 nm波长下测样品吸光度值As；以蒸馏水代替NaNO2标准液，作为空白对照，测其吸光度值Ao，以蒸馏水代替样品液测得样液本底吸光度值Ab，计算阻断率X=[Ao-（As-Ab）]/Ao×100%。平行重复3次，并求平均值。

1.3 数据统计

实验数据使用Stata软件处理，进行一般线性模型分析和拟合线图分析，通过SPSS19.0进行IC50值计算。

2 结果与分析

2.1 夏枯草提取物对亚硝酸盐的清除作用

不同质量浓度的夏枯草水提取物（0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL）在体外模拟胃液反应条件下，其对亚硝酸盐的清除效果如图1。清除效果随着提取物浓度的增加而增强。考察反应时间对清除效果的影响发现，样液浓度在≤1.50 mg/mL时，亚硝酸盐清除率在前1 h内，表现为随处理时间延长，清除率略微下降，但继续延长处理时间，清除率几乎都表现为明显的上升。当水浴时间为30、60、120和180 min时，水提取物溶液对亚硝酸盐的清除效果半数抑制率IC50值分别为0.519、0.676、0.327和0.290 mg/mL。综合考虑样液质量浓度和反应时间的关系，可以看出，夏枯草水提取物清除亚硝酸盐的最适质量浓度1.00 mg/mL，最佳反应时间为120 min，清除率为90.68%。

不同质量浓度的夏枯草醇提取物（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）在体外模拟胃液反应条件下，其对亚硝酸盐的清除效果如图2。当反应时间较短，即反应时间为30 min和60 min时，夏枯草醇提溶液对亚硝酸盐的清除效果较差。而当延长反应时间，其清除效果表现为随处理时间增长而显著上升。在作用时间相同的情况下，夏枯草醇提溶液的亚硝酸盐清除率表现为随样液质量浓度增加而增大的趋势。水浴时间为30、60、120和180 min时，夏枯草醇提取物对亚硝酸盐的清除效果的半数抑制率IC50值分别为1.659、1.408、0.376、0.341 mg/mL。综合考虑样液质量浓度和反应时间的关系，可以看出，夏枯草醇提取物清除亚硝酸盐的最适质量浓度为2.00 mg/mL，最佳反应时间为120 min，清除效果可高达92.06%。

2.2 夏枯草提取物对亚硝胺合成的阻断作用

由图3可知，在模拟胃液反应体系中，夏枯草水提取物对亚硝胺合成的阻断效果也与其样液浓度呈正相关。水浴时间为30、60、120和180 min时，夏枯草水提取物对亚硝胺合成的阻断效果的半数抑制率IC50值分别为2.159、1.759、0.922、0.899 mg/mL。综合考虑样液质量浓度和反应时间的关系，可见，夏枯草水提取物清除亚硝酸盐的最适质量浓度2.50 mg/mL，最佳反应时间为120 min，阻断效果可达94.27%。

由图4可知，夏枯草醇提取物对亚硝胺合成的阻断能力与其浓度同样呈正相关。水浴时间为30、60、120和180 min时，夏枯草醇提取物对亚硝胺合成的阻断效果的半数抑制率IC50值分别为6.589、5.182、3.320、1.614 mg/mL。该结果表明夏枯草醇提取物具有阻断亚硝胺合成的作用，且随着反应时间的延长而阻断率提高。综合考虑样液质量浓度和反应时间的关系，可以看出，夏枯草醇提取物清除亚硝酸盐的最适质量浓度7.50 mg/mL，最佳反应时间为120 min，阻断效果可达92.89%。

2.3 夏枯草提取物对亚硝酸盐清除效果

由表1、2可知，亚硝酸盐的清除率与夏枯草水提取物的质量及不同作用时间均呈统计显著的正相关关系。根据回归分析，R2表示清除率变异的83%由夏枯草水提取物质量浓度导致。当其他因素不变时，作用时间每增加1 min，清除率平均增长0.16%；当其他因素不变时，夏枯草水提取物质量浓度每增加1 mg/mL，清除率平均增长32.70%。即对该体系的亚硝酸盐清除作用中，由夏枯草水提取物的质量浓度占主导作用。

由表3、4可知，亚硝酸盐的清除率与夏枯草醇提取物的质量浓度及不同作用时间均呈线性关系，差异性极显著。根据表4中F检验的P值及R2可知，本模型总体统计显著，拟合度较高。当其他因素不变时，作用时间每增加1 min，清除率平均增加0.27%，当其他因素不变时，醇提取物质量浓度每增加1 mg/mL，清除率平均增长13.29%。即夏枯草醇提取物的质量浓度对亚硝酸盐的清除作用影响较大。

2.4 夏枯草提取物对亚硝胺合成阻断结果

由表5、6可知，亚硝胺合成的阻断率与夏枯草提取物的质量浓度以及不同作用时间均呈线性关系，阻断效果伴随提取物质量浓度的增大而增强，伴随作用时间的延长而增强，差异性极显著。根据图6可知，由于F检验的P值为0，模型总体是统计显著的，R2大于80%，说明模型的拟合度较高，模型较好。当其他因素不变时，处理时间每增加1 min，清除率平均增加0.17%；在其他因素不变情况下，夏枯草水溶液质量浓度每增加1 mg/mL，清除率平均增长6.15%。提取方式和阻断率在1%显著性下相关，醇提溶液较水提溶液在其他因素不变的情况阻断率平均低28%，即在相同体系下，相同质量浓度的夏枯草水提取物比醇提取物能够更好阻断亚硝胺合成。

2.5 夏枯草提取物与维生素C对亚硝酸盐清除能力与亚硝胺合成阻断能力的比较

以维生素C为阳性对照，结果如表7所示。当质量浓度为1 mg/mL，作用时间为60 min时，夏枯草水提取物清除亚硝酸盐的能力较维生素C低29.87%，夏枯草醇提取物清除亚硝酸盐的能力较维生素C低53.30%，夏枯草水提取物阻断亚硝胺合成的能力为相同体系下的维生素C阻断能力的56.38%，而夏枯草醇提取物对亚硝胺合成阻断的能力为维生素C的12.31%。这说明夏枯草提取物能够有效对亚硝酸盐进行清除和阻断体系内亚硝胺的合成。说明夏枯草可能具有一定的肿瘤化学预防作用，可作为抑亚硝化清除剂或肿瘤预防剂。

3 讨论

近年来，国内多篇文献报道了众多植物提取物在体内外实验中在清除亚硝酸盐和对阻断亚硝胺合成上具有良好的效果[19-22]。本实验表明，在模拟人体胃液条件下，夏枯草水提取物溶液和醇提取物溶液均能有效的清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成，其中水提取物效果较好。亚硝酸盐的清除率和亚硝胺合成的阻断率与提取物质量浓度及作用时间呈显著的正相关关系，而夏枯草提取物的质量浓度对亚硝酸盐的清除率和亚硝胺合成的阻断率的相关性较大。

之前的研究显示，夏枯草中主要含有三萜及其皂苷，酚酸，甾醇及其苷，黄酮[23]及其苷，有机酸，挥发油及糖类等成分[24-26]。药效关系研究表明，抗氧化活性成分多为多糖[27-28]。亚硝酸盐在酸性环境下，通常以氧化性为主，则抗氧化物质通过还原作用达到清除亚硝酸盐的目的。当往夏枯草提取物溶液中加入亚硝酸钠与二甲胺时，夏枯草提取物优先与亚硝酸钠发生反应，避免了二甲胺与亚硝酸钠生成二甲基亚硝胺。本实验中，夏枯草水提取物对亚硝酸盐的清除效果及对亚硝胺合成的阻断效果，相较于夏枯草醇提取物更佳，可能是因为水提取物中含有大量多羟基多糖类化合物，抗氧化性较强，清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的能力也较强。但本实验的供试材料夏枯草的水提取物和醇提取物均是植物粗提取物，其发挥主要作用的成分尚不能确定。因而后续的研究可进一步对提取物进行柱色谱分离纯化、并探讨其与亚硝酸盐作用的构效关系，同时进行毒理学评价分析，为体内胃酸条件下亚硝胺的控制提供理论指导和技术参考。

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