甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法的建立

汪涵 吴伟怀 杨旭光 杨先锋 李锐 郑金龙 黄兴 梁艳琼 贺春萍 易克贤

摘 要 为建立甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法，本研究利用真菌DNA内源转录间隔区通用引物ITS1/ITS4扩增甘蔗黑顶柄锈菌DNA，并对其扩增产物进行克隆测序，获得序列于NCBI网站进行比对分析，并于该序列多态性丰富区域设计了2对引物PM2F/R、PM3F/R。通过对同寄主不同病原菌、以及不同属的锈菌DNA进行PCR检测以验证引物的特异性。结果表明，在优化的单一PCR反应体系与程序条件下，2对引物均仅能从甘蔗黑顶柄锈菌中扩增出约474 bp和363 bp的特异条带，而从其它真菌DNA中均扩增不出任何条带。进一步将引物PM2F/R作为第一轮扩增引物、PM3F/R作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增后，其检测灵敏度在DNA水平上可达0.001 ng/μL，较常规PCR提高100倍。由此表明，依据本研究所设计的2对引物而建立的快速、灵敏、准确的甘蔗黑顶柄锈菌的检测技术，对病原菌的早期診断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。

关键词 甘蔗褐锈病；黑顶柄锈菌；巢式PCR分子检测

中图分类号 S435.661 文献标识码 A

Abstract The objective of this study is to develop a nested-PCR method to rapidly and accurately detect sugarcane brown rust. In the present study， based on the differences in the sequences of internal transcribed spacer（ITS）ITS1-ITS4 sequence ribosomal DNA of P. melanocephala in sugarcane and the other closely related species at the NCBI web， two pairs of primers PM2F/R and PM3F/R were designed and a PCR assay was developed. Among the same host and rust fungi of different genera including brown rust was implemented to determine the primer specificity that two pairs of primers were amplified， only two PCR bands of 474 bp and 363 bp were amplified with DNA extracted from all isolates of P. melanocephala in sugarcane， while other tested isolates had no corresponding bands. The detection sensitivity increased 100-fold to 0.001 ng/μL genomic DNA by developing a nested PCR procedure with bacterial universal primer pair PM2F/R as the first round primers and PM3F/R as the second round primers. Therefore， this study set up a fast， sensitive and accurate nested PCR detection system of sugarcane brown rust pathogen. It has important significance in early diagnosis， and rapid detection and research on epidemiology of sugarcane brown rust.

Key words Sugarcane brown rust disease； Puccinia melanocephala Sydow； nested PCR detection system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.021

由黑顶柄锈菌（Puccinia melanocephala Sydow）引起的甘蔗褐锈病是我国甘蔗种植区普遍发生的一种病害。该病依赖夏孢子传播，借风力附着在叶片表面，经气孔侵入植物体内。主要为害叶片，老叶较幼叶易感病。病斑分布较分散，多发自叶顶端。初期病斑长形，淡绿色至黄色；后期病斑扩大，长2～10 mm，有时可达30 mm，宽1～3 mm。夏孢子堆呈红褐色，主要着生在叶背，严重时，叶面也可见。受害后的甘蔗分蘖减少，蔗茎变细[1-4]。甘蔗褐锈病一旦发生，很容易引起流行，发病田地一般减产15%～30%，严重时减幅可达40%以上[5-6]，已成为世界上普遍发生，危害最严重的甘蔗病害之一。自1977年该病在我国首次发生以来，现已遍及云南、福建、四川、江西、海南和广东等蔗区，造成甘蔗产量及其含糖量的极大损失[7-9]，严重影响了蔗糖产业的持续稳定发展[10-11]。

目前甘蔗褐锈病的防治仍以加强检疫、推广脱毒健康苗和选用抗病品种为主，以栽培管理和药剂防治为辅。因此，建立一种快速、高效、实用的甘蔗褐锈病早期检测技术，对病害防治具有重大意义。迄今为止，针对甘蔗黑顶柄锈菌的检测技术已有传统田间诊断、免疫学诊断、分子检测诊断等[12]，其中传统田间诊断一直以来都是甘蔗锈病的主要检测方法，该方法主要通过外部形态观察发病症状，显微观察孢子形态确认是否感病，但耗时长，灵敏度较低，结果的准确性和可信度也在很大程度上取决于检测人员的技术水平和经验，很容易错过病害防治的最佳时期；免疫学诊断也存在耗时长，易出现假阳性等缺点[13]；比较而言，以PCR为基础的分子检测技术具有快速、灵敏度较高的优点。

针对甘蔗黑顶柄锈菌常规PCR分子检测技术虽已建立[14]，但该检测技术灵敏度较低[15]，比较而言，巢式PCR具有更高灵敏性。目前，巢式PCR检测技术已经在甘蔗黑穗病菌[16]，西瓜细菌性果斑病菌[17]，琯溪蜜柚黑斑病菌[18]，辣椒疫霉菌[19]，烟草青枯病菌[20]等多种植物病原菌检测中得以应用。而黑顶柄锈菌的巢式PCR检测技术鲜有报道[21-22]。为此，本研究基于真菌种间ITS区段序列高度变异和种内稳定性特点，设计2对甘蔗黑顶柄锈菌特异性引物，旨在建立甘蔗黑顶柄锈菌的巢式PCR检测体系，以期为该菌的早期诊断、快速检测等提供新的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本实验采用甘蔗褐锈病菌（Puccinia melanocephala Sydow）、甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea）、甘蔗环斑病菌（Leptosphaeria sacchari Breda）、甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、甘蔗黄锈病菌（Puccinia kuehnii）、咖啡驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）、葡萄层锈菌（Phakopsora ampelopsidis Diet.et syd.）、鸡蛋花鞘锈菌（Coleosporium plumierae）等作为供试菌株。供试菌株具体寄主来源详见表1，所有菌株DNA均保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

1.1.2 试剂 DL 2 000标准分子量，10×rTaq Buffer，2.5 mmol/L dNTPs，以及rTaq DNA Polymerase均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组总DNA提取 甘蔗褐锈病菌DNA采用CTAB法提取，其他供试菌株的DNA均采用真菌DNA提取试剂盒（E.Z.N.ATM Fungal DNA kit，Omega公司，美国）提取，具体实验步骤参考说明书进行。

1.2.2 甘蔗黑顶柄锈菌ITS序列的重组质粒构建及特异性引物设计 利用真菌ITS系列扩增通用引物ITS1/ITS4[23]，采用20 μL反应体系：ddH2O 14.2 μL，10×rTaq Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，rTaq DNA Polymerase 0.2 μL，10 μmol/L的上下通用引物各0.5 μL，DNA模板（30 ng/μL）1 μL，对甘蔗黑顶柄锈菌基因组DNA进行扩增。PCR反应在Mastercycler gradient Mastercycler PCR扩增仪上进行。反应程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。扩增结束后取8 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统检测并拍照保存。取4 μL PCR扩增产物与T1载体连接后，转化到大肠杆菌培养，采用OMEGA质粒提取试剂盒，提取构建的重组质粒DNA，委托英潍捷基（上海）贸易有限公司广州实验室测序。

将测序结果与NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中已登录的锈菌近缘种基因进行同源序列比较，选取多态性丰富位点进行引物设计，设计好的引物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司广州合成部合成。

1.2.3 巢式PCR扩增体系及条件优化 单一PCR反应体系与巢式PCR扩增体系一致，均为20 μL反应体系，其具体程序与参数同1.2.2。以单一体系为参考，分别对巢式PCR扩增内外2轮引物的退火温度进行优化，分别设置55、58、61、64 ℃ 4个温度梯度，并对其扩增产物进行凝膠电泳检测。

1.2.4 引物特异性分析 基于引物的最佳退火温度，选取4个甘蔗黑顶柄锈菌、2个甘蔗赤腐病菌、2个甘蔗黑穗病菌、2个甘蔗环斑病菌、2个甘蔗黄锈病菌、2个咖啡驼孢锈菌、葡萄层锈菌与鸡蛋花鞘锈菌各1个，共16个菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，并以灭菌ddH2O为阴性对照，检测2对引物的特异性。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，克隆测序，通过序列比对验证其准确性。

1.2.5 灵敏度检测 通过超微量分光光度计（NanoDrop 2000c）将甘蔗黑顶柄锈菌ITS序列的重组质粒DNA初始浓度调整为100 ng/μL，采用10倍梯度稀释法依次稀释为10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL共7个不同浓度梯度。分别取1 μL甘蔗黑顶柄锈菌ITS序列的重组质粒DNA为模板，以合成的2对引物分别进行单独PCR扩增，反应体系和扩增程序同1.2.4。反应结束后将PM2F/R PCR产物稀释10倍，分别取1 μL为DNA模板，用引物PM3F/R进行第2轮PCR扩增，反应体系与扩增程序同1.2.4。扩增结束后取8 μL 2轮的PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 田间发病甘蔗植株检测 采集田间不同发病程度的甘蔗叶片，以发病程度从高到低的甘蔗植株基因组DNA（30 ng/μL）为模板，依次为3株发病典型症状，2株发病轻微症状，2株疑似症状、2株病害爆发区域内的无病症叶片。甘蔗黑顶柄锈菌ITS序列的重组质粒DNA为阳性对照，以甘蔗健康植株基因组DNA为阴性对照。用PM2F/R、PM3F/R引物分别进行常规PCR检测与巢式PCR检测。

2 结果与分析

2.1 特异引物的设计与同源性分析

将测序结果与近源种进行多重比较，获得了甘蔗黑顶柄锈菌ITS序列多态性丰富区域。最终于多态性区域内设计了PM2F/R与PM3F/R 2对甘蔗黑顶柄锈菌的特异引物。具体引物序列为：PM2F：5′-GGCTTCATTGCCACATTACC-3′，PM2R：5′-TTTGAGGTCTTAAATGTTAGGGG-3′。PM3F：5′-CATAAACACTATATTAAAGATTTTGAAG-3′，PM3R：5′-GTATTGCTACTTTCCTTGATGCTC-3′。2者包含引物序列在内的预期片段大小分别为474、363 bp。将2对引物序列分别于NCBI网站中进行同源性搜索，结果均显示只与NCBI数据库中甘蔗黑顶柄锈菌具有100%的同源性。

2.2 PCR扩增体系退火温度优化

优化结果表明，引物PM2F/R在退火温度为61 ℃条件下，其条带较为均匀清晰（图1-A）；而引物PM3F/R在退火温度为55 ℃和58 ℃条件下其扩增出来的条带较为清晰（图1-B）。故后续扩增中，将引物PM2F/R与PM3F/R的退火温度分别设定为61 ℃与58 ℃。

2.3 引物特异性检测

2对引物均只能从ITS序列的重组质粒DNA模板中扩增到预期的目的条带，其它同寄主不同病原菌以及不同属的锈菌DNA均未扩增出任何条带（图2）。扩增出的阳性条带通过克隆测序后与NCBI数据库中甘蔗黑顶柄锈菌序列完全一致，进一步表明该引物具有很高的特异性。

2.4 普通PCR及巢式PCR灵敏度分析

灵敏度检测结果表明，当模板浓度稀释到0.1 ng/μL时，引物PM2F/R与PM3F/R在常规PCR扩增中均能检测出预期目标条带，而模板浓度为0.01 ng/μL时，二者均未检测出任何条带（图3-A、B），由此表明，引物PM2F/R与PM3F/R在普通PCR扩增中其灵敏度为0.1 ng/μL。而在PM2F/R作为外引物，PM3F/R作为内引物的巢式PCR中，当模板浓度稀释到0.001 ng/μL时，巢式PCR仍能检测出目标条带，而当模板浓度稀释到0.000 1 ng/μL时，未能检测出任何条带（图3-C），由此表明，巢式PCR检测灵敏度为0.001 ng/μL。换言之，巢式PCR检测灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍。

2.5 甘蔗田间植株检测

对9份不同发病程度的田间甘蔗植株样品进行检测，结果显示：以引物PM2F/R进行的常规PCR仅能从其中3份样品中检测为阳性，即能稳定地扩增出一条分子量为474 bp的特异条带，其余6份均未检测出任何条带（图4-A）；以引物PM3F/R进行的常规PCR仅能从其中5份样品中检测出条带，即能稳定地扩增出一条分子量为363 bp的特异条带，其余均未检测出任何条带（图4-B）；而由二者组成的巢式PCR则从全部甘蔗植株样品中均能检测出一条分子量为363 bp的特异条带（图4-C）。进一步测序比对表明，扩增出的条带与甘蔗黑顶柄锈菌具有100%的一致性，说明该巢式PCR检测技术能用于甘蔗黑顶柄锈菌的快速检测与诊断。

3 讨论

寻找抗锈病品种是目前一种较为重要甘蔗抗锈病的方式，但在病害早期精确灵敏识别病原菌也是非常必要的手段。甘蔗褐锈病早期症状与甘蔗其它叶斑病症，尤其是与黄锈病早期症状比较相似，虽然甘蔗褐锈病与黄锈病可以通过田间甘蔗感病症状及夏孢子的颜色和形态加以区别。但需待孢子堆完全成熟通过高倍显微镜才可鉴别，且受繁殖季节、病原保存、仪器设备等诸多因素的限制[24]。因此，可利用实用可靠的分子生物检测技术来区别甘蔗褐锈病。但需设计出高度特异的分子标记。

参照巢式PCR检测琯溪蜜柚黑斑病菌[18]、烟草青枯病菌[20]采用病原菌通用引物作为第一轮PCR的引物，本实验通过真菌通用引物ITS1/4，扩增得到黑顶柄锈菌的ITS序列。通过序列比对，在获得的适宜区域设计了2对特异引物（PM2F/R和PM3F/R），分别对同寄主甘蔗赤腐病菌、甘蔗黑穗病菌、甘蔗环斑病菌、甘蔗黄锈病菌、以及不同属的咖啡驼孢锈菌菌株基因组进行PCR扩增，最终只有甘蔗黑顶柄锈菌DNA中能够检测出大小分别为474、363 bp的条带，空白对照及其余菌株DNA模板均无扩增产物。通过对扩增产物的克隆测序以及序列比对，验证了该引物的特异性。由此表明，巢式PCR检测能够有效区分甘蔗褐锈病菌、甘蔗黄锈病菌及其他病原菌，具有高特異性。

分子检测中灵敏度是衡量检测技术的另一个重要参数。本实验通过对常规PCR和巢式PCR检测甘蔗褐锈病菌DNA模板的灵敏度进行比较分析。结果显示常规PCR能检测到浓度为0.1 ng/μL的甘蔗褐锈病菌DNA模板，而巢式PCR能检测到的浓度为0.001 ng/μL，是常规PCR的100倍，与番石榴焦腐病菌的检测灵敏度属于同一级别[25]。可见巢式PCR较常规PCR更为灵敏。在田间检测中，相较常规PCR，巢式PCR能检测出未显症状的甘蔗植株潜伏期样品中的病原菌，可满足对甘蔗褐锈病菌的早期检测与诊断需求，为及早发现病害，及时采取防治措施，有效预防病害的大规模爆发，减少产量损失提供了依据。值得注意的是，相较于常规PCR检测，巢式PCR灵敏度虽可提高10～1 000倍，但操作过程中极易造成污染[15]。因此，实际操作过程中需进行严格细致的实验操作，以防假阳性的出现。

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