基于cDNA—AFLP技术分析半膜覆盖下玉米大喇叭口期基因差异表达

高海荣 李倩 王玉芬 郭九峰 马梦宇 李玉东 白岚方

摘 要 为了探讨半膜覆盖调控玉米生长的差异表达基因及分子机制，以‘浚单29为材料，露地栽培作为对照，与半膜覆盖间隔种植，利用cDNA-AFLP技术，采用90对单引物筛选半膜覆盖下差异表达基因，并进行生物信息学分析。结果表明，利用90对单引物组合共扩增出2 298条差异片段，其中上调表达的有1 429条，占总条带数的45%；下调表达的有869条，占总条带数的23.7%；无差异表达的有877条，占总条带数的27.6%。选择重复扩增稳定的20条差异片段进行回收测序，经过Blast数据库对比和基因注释分析，再将所得的15条差异片段按功能分为细胞骨架相关基因（13.3%）、能量代谢相关基因（13.3%）、细胞挽救和防御相关基因（6.7%）、转录过程相关基因（40%）、胞内转运相关基因（6.7%）和未知功能基因（20%）6大类。分析其中一些重要的基因，如RPM1在逆境抗性中起作用，MYM锌指蛋白、BCAS2蛋白和EIF3B翻译起始因子都与调控转录翻译相关。通过cDNA-AFLP技术筛选了多个半膜覆盖下差异表达的基因，为揭示半膜覆盖影响玉米生长发育的分子机制提供了基础资料。

关键词 玉米；栽培方式；半膜覆盖；cDNA-AFLP；差异表达

中图分类号 S513 文献标识码 A

Abstract In order to investigate the molecular mechanism of the regulation of maize growth under partial plastic film-mulched cultivation， the differentially expressed genes were screened by 90 pairs of single primers using cDNA-AFLP technique， and bioinformatics analysis was carried out with Jundan 29 as the material under open-field-cultivation for the control and partial plastic film-mulched. The results showed that a total of 2 298 differential fragments were amplified by the 90 primer pairs， of which 1 429 were up-regulated（45% of the total number of bands）， 869 were down-regulated（23.7%of the total number of bands）. 877 genes were expressed without difference（27.6% of the total number of bands）. Twenty different differential fragments were selected and sequenced. Used Blast database comparison and gene annotation analysis， fitteen fragments could be divided into 6 groups according to the functions， namely cytoskeleton genes（13.3%）， energy metabolism gens（13.3%）， cell rescue and defense genes（6.7%）， transcription genes（40%）， intracellular transport related genes（6.7%）and unknown function（20%）. Some important genes were analyzed. For example， RPM1 protein plays a crucial role in adversity resistance， MYM zinc finger protein， BCAS2 protein and EIF3B are related to the regulation of transcription and translation. This study would provide basic data for revealing the molecular mechanism of partial plastic film-mulched affecting maize growth and development.

Key words Maize； cultivation pattern； partial plastic film-mulched； cDNA-AFLP； differential gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.018

玉米（Zea mays L.）是重要的糧食、经济和饲料作物。和玉米一样，大多数作物对于干旱敏感，干旱地区的作物生长发育会受到不同程度的影响。干旱胁迫影响到植物的许多进程，如细胞壁的延伸受抑，降低光合速率以及叶绿体对光能的吸收能力，影响光合碳同化和渗透调节等方面[1-3]。覆盖地膜栽培在旱作农业方面起到很大的帮助，尤其是北方地区，地膜覆盖栽培可以有效的减少地面水分散失，存储雨水，增加地表温度和抗虫防病等[4-7]。因此，筛选和分离地膜覆盖影响玉米生长的相关基因，探寻地膜覆盖调控玉米生长的分子机理，为玉米栽培和育种方面提供有价值的基因资源。

半膜覆盖和全膜覆盖已经广泛应用到世界各地，尤其干旱地区，带来的经济效益已得到广泛认可。李霞[8]在研究抗旱栽培模式的技术效益时发现，半膜覆盖垄沟栽培和全膜双垄沟播前覆膜较不覆膜栽培的增产率分别是149.56%和223.31%。长时间全垄地膜覆盖会导致植株侧根量减少，根层变浅，中后期土壤温度偏高，植物易早衰等。半膜覆蓋的优势有：①作物根系一半处于膜内，一半处于膜外，能提高肥料利用率，促进根系发育和生长；②减少一半地膜使用量，有效降低“白色污染”[9]。

cDNA-AFLP是Bachem等[10]于1996年提出的一种差异表达鉴定技术，是结合了RT-PCR与AFLP 两种技术建立的，主要用于RNA指纹图谱分析，具有可靠性高，重复性好和不需预知序列信息等优点，已经被广泛的用于基因差异显示、表达基因遗传连锁作图和基因克隆。Melloul M等[11]利用cDNA-AFLP技术筛选硬粒小麦（Triticum durum）在干旱胁迫下差异表达的基因。高凤华等[12]应用相同技术，比较干旱胁迫条件下水稻和旱稻转录本表达谱，结果表明57个基因在旱稻中特异表达，38个在水稻中特异表达，这些基因可能包括在干旱抗性中起作用的细胞挽救和防御基因，信号转导分子，生长发育必需的核苷酸和氨基酸生物合成基因以及生长发育调控基因等。近年来，cDNA-AFLP 技术被广泛应用在作物逆境胁迫的差异基因表达方面，而对作物不同栽培方式下相关基因的鉴定和发掘方面涉及很少。

然而，目前作物不同栽培方式的研究主要集中在耕作方式、改善土壤理化性状、提高土壤肥力、促进早生快发和提高产量与品质等方面，而对其生理和分子机制方面的研究还较少。研究不同栽培方式下，作物基因的差异表达将已经成为目前的研究热点。本实验以玉米露地种植为对照（CK），同时将半膜覆盖间隔种植，在大喇叭口时期取样，利用cDNA-AFLP技术分离筛选差异表达的基因，揭示基因表达谱的变化情况，旨在分子水平上了解半膜覆盖调控玉米生长发育的分子机制，对玉米栽培的生理和分子方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 选用玉米品种‘浚单29号，在内蒙古自治区赤峰市松山区试验田进行种植。将半膜覆盖和露地栽培（CK）间隔种植，大喇叭口期分别在玉米顶端叶片取样10株，无菌水冲洗后用液氮冷冻，材料置于小液氮罐中带回，保存在-70 ℃冰箱中备用。

1.1.2 主要试剂 PrimeScript Double Strand cDNA Synthsis Kit（6111A）购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司；DEPC购自上海VETEC复申生物科技有限公司；MseⅠ购自美国NEB公司；PstⅠ购自加拿大Fermentas公司；T4 DNA Ligase、Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）购自美国Thermo Scientific公司；接头、预扩增引物及选择性扩增引物均由上海Invitrogen有限公司合成；其他药品均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 取约400 mg的冷冻玉米叶片材料，分别在液氮中混样充分研磨后，按照改良的SDS法提取总RNA，测OD值确定RNA的浓度，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。加入一定量的DNase消化gDNA；cDNA的合成按照PrimeScript Double Strand cDNA Synthsis Kit使用说明，分为cDNA第一条链的合成，第二条链的合成及cDNA双链的精制纯化过程。

1.2.2 酶切及连接 用两种高频限制性内切酶MseⅠ和PstⅠ分别对两种样品的cDNA分别进行双酶切，反应体系为dscDNA（100 ng/μL）5 μL，MseⅠ1 μL，PstⅠ1 μL，10×Fast Digest Buffer 2 μL，ddH2O补充至总体积为20 μL；反应条件为37 ℃反应20 min，65 ℃灭活5 min。

取10 μL酶切产物，向其中加入MseⅠ接头（5 μmol/L）1 μL，PstⅠ接头（50 μmol/L）2 μL，T4 DNA Ligase（5 U/L）1 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，ddH2O补充至总体积为20 μL。反应条件为22 ℃反应1～2 h，65 ℃灭活10 min。酶切连接产物保存在-20 ℃冰箱中备用。接头序列及预扩选扩引物见表1。

1.2.3 预扩增体系与选择性扩增体系 以酶切连接产物原浓度及不同稀释倍数（10、20倍稀释）作为预扩增体系PCR模板，反应体系为酶切连接产物2 μL，M00引物（10 pmol/μL） 1 μL，P00引物（10 pmol/μL）1 μL，PCR Master Mix（2X）10 μL，ddH2O补充至总体积为20 μL。反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后筛选最佳模板稀释倍数。

将预扩产物以原浓度和不同稀释倍数（20、40、60、80倍稀释）作为选择性扩增体系PCR模板，反应体系为预扩增产物2 μL，使用两种单引物组合，即MseⅠ+NN与MseⅠ+NN，另一组为PstⅠ+NNN与PstⅠ+NNN，每个引物各加1 μL（引物浓度均为6 pmol/μL），PCR Master Mix（2X） 10 μL，ddH2O补充至总体积为20 μL。反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，65 ℃退火40 s，每个循环降低0.7 ℃，72 ℃延伸1 min，循环12次；94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循环28次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。电泳检测确定最佳稀释倍数。

1.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 选择性扩增产物中加上样缓冲液并混匀，变性10 min后，在5%的聚丙烯酰胺凝胶上以70 W功率电泳2 h，银染并统计条带结果。

1.2.5 差异条带的回收及测序 回收有明显差异的条带，装于200 μL离心管中，加入30 μL ddH2O，100 ℃水浴15 min，10 000 r/min离心10 min，待冷却后取上清，用与差异条带相同的引物进行2次PCR。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，选择单一且清晰的条带送英潍捷基公司测序。

cDNA-AFLP试验进行了3个生物学重复和技术重复。

1.2.6 生物信息学分析 将测序成功的序列在NCBI（http： //www.Ncbi.nlm.nih.gov）和MaizeGDB （http： //www.maizegdb.org/）网站上进行同源序列比对，推断基因的功能及其代谢通道。

2 结果与分析

2.1 玉米叶片RNA的提取及cDNA的合成

玉米嫩叶用改良的SDS法提取RNA后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，结果见图1，可以清晰的看到3条亮带，即28S RNA、18S RNA和5S RNA；浓度用超微量分光光度计进行检测，样品的OD260/OD280介于1.92～2.07之间，RNA纯度较高，可以继续进行AFLP分析的下一步试验。

图2所示为cDNA的合成，可知经反转录后的cDNA呈弥散状，大小在500～2 000 bp之间，取少量样品进行超微量紫外分光检测，cDNA的OD260/OD280介于1.81～1.95之间，含量在100～180 ng/μL，说明含量充足，符合酶切要求。

2.2 预扩增体系、选择性扩增体系的建立与优化

cDNA酶切连接接头后，产物稀释20倍稀释时条带较明亮且集中，大小为1 000 bp左右，效果最佳，故选择将酶切连接产物稀释20倍作为预扩增的模板。选择性扩增时，将预扩增产物稀释60倍作为模板，以单引物不同碱基作为选择性扩增的1对引物组合进行扩增。部分选择性扩增电泳结果如图3 所示。

2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化

利用45对MseⅠ+NN与MseⅠ+NN引物组合与45对PstⅠ+NNN与PstⅠ+NNN引物组合，研究了露地栽培和半膜覆盖下基因的差异表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，可观察到大量差异表达条带，表达有无差异和表达量差异，都记为差异表达条带（部分聚丙烯酰胺凝胶电泳示差异表达条带见图4）。经统计，共得到2 298条差异条带，约占总条带数的 72.4%，其中上调表达1 429条，下调表达869条。

2.4 差异条带回收测序及序列同源性分析

用手术刀切取20个差异条带，进行2次PCR之后，产物回收测序，获得18个成功的测序结果。利用Blast系统比对分析，检索到与Gene Bank 中已有的基因具有同源性的片段共有15个，只有3个没有显著的同源序列。通过来源可以把这些序列分类为：与玉米同源性较高的序列有5条，与其他植物同源性较高的有2条，与动物同源性较高的有3条，与微生物同源性较高的有5条（表2）。利用生物信息学知识将15条差异条带进行基因注释分析，按功能可分为细胞骨架相关基因（13.3%）、能量代谢相关基因（13.3%）、细胞挽救和防御相关基因（6.7%）、转录过程相关基因（40%）、胞内转运相关基因（6.7%）和未知功能基因（20%）6大类。

3 讨论

3.1 半膜覆盖调控玉米的生长

半膜覆盖作为一种常见的作物增收的栽培方式，在播种的同时覆盖地膜，以起到土壤水分向耕层移动，并且保水增温，提早生育期等，研究某个时期覆盖地膜和露地栽培的基因差异表达，利用cDNA-AFLP的技术特点，可以筛选出差异表达的基因。覆膜玉米在其生理指标方面，覆膜能够平均升高土壤温度（5 cm土层）1.7 ℃，增加土壤含水量，单株叶面积和叶绿素含量始终大于露地栽培[13]；在生化指标方面，同样在大喇叭口期，覆膜与露地栽培相比，玉米叶片中SOD（超氧化物歧化酶）活性和丙二醛（MDA）含量都相对较低，说明覆膜条件下能有效缓解玉米植株的氧化衰老，膜质过氧化程度减轻，同时脯氨酸含量也显著降低，在一定程度上反应了覆膜玉米遭受干旱胁迫程度较轻，且净光合速率和蒸腾速率明显大于露地栽培[14]。另外，覆膜后耕层土壤细菌、放线菌和真菌会增加2～4倍，土壤中微生物数量增加，微生物活动旺盛，必然会影响土壤有机质的分解， 从而提高作物对养分的吸收和利用率[15]。本实验预期得到的差异基因应当主要与水分、温度及微生物等调节玉米生长发育过程有关，包括根的水分吸收、能量的电子传递、细胞的信号转导和对逆境的抗性生理等。

3.2 cDNA-AFLP显示基因差异表达

cDNA-AFLP技术有着多态性丰富、效率较高，而且重复性好，转录产物表达较高时，扩增条带的强度能准确反应基因间表达量的差别，可以有效的应用于表达基因遗传连锁作图和基因克隆，还可以同时研究不同生长时期和不同栽培条件下基因的差异表达。cDNA-AFLP技术中预扩模板和选扩模板浓度的稀释是关键之一， 稀释倍数太小，模版过早被耗尽，导致遗传信息复制不完全，且极易在电泳时发生拖尾现象，若稀释倍数太大则扩增条带很弱或不显示，导致扩增信号强度减弱，也不利于多态性检测。常见的选扩引物为双引物组合（MseⅠ+NN与PstⅠ+NN），也有使用单引物组合的，如Habu Y等[16]用一个识别4碱基的限制性内切酶，对牵牛花（Ipomoea purpurea）红花和白花的花芽cDNA進行酶切，扩增引物使用单引物（M+N3， M+NNN3），即M引物3端有1个随机碱基，另一个M引物3端有3个随机碱基，最终利用cDNA-AFLP技术筛选出了一个只在红花中出现的查尔酮合成基因（CHS）。本试验进行改进后采用单引物组合（MseⅠ+NN与MseⅠ+NN，PstⅠ+NNN与PstⅠ+NNN），利用引物在不同碱基之间的组合，理论上MseⅠ+NN单引物组合有162个，PstⅠ+NNN单引物组合有163个，笔者只选择了MseⅠ+NN和PstⅠ+NNN单引物组合各45对，结果显示扩增片段具有较好的多态性。本研究通过对反应条件的反复优化，构建了cDNA-AFLP体系，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上，良好的显示出了选择性扩增片段，通过分析，可以显著分辨露地栽培和半膜覆盖下玉米叶片基因表达的差异片段。

3.3 半膜覆蓋调控玉米生长的相关基因

3.3.1 与抗病相关基因 本试验筛选到一个与玉米抗病蛋白RPM1高度同源的基因（编号4），RPM1基因是植物主要的一类抗病蛋白，越来越多证据表明，RPM1蛋白参与植物的许多生理过程，最重要的功能就是调节抗病防御反应；RPM1基因在拟南芥中对于丁香假单胞杆菌（pseudomonas syringae）具有抗性[17]，Grant等[18]在研究此基因的结构时发现，RPM1被限制在一个5 kb的区域内，并且识别丁香假单胞杆菌avrRpm1和avrB基因的表达。RPM1作为一个螺旋NBS-LRR蛋白，RPM1与质膜定位蛋白RIN4相互作用[19]；RIN13作为一个耦合子来增强RPM1的功能[20]；RPM1基因还可以促进细胞质钙离子浓度的快速持续增加，来进行植物必要的氧化迸发和过敏性细胞死亡等过程[21]，氧化迸发是细胞水平上作物对付病原菌侵染的第一步，过敏性细胞死亡也是在作物遭受非亲和病原物侵染或激发因子的刺激后发生的。另外在高粱、水稻和二穗短柄草等植物中点发现了抗病基因RPM1；抗病蛋白已公认在正常生长和胁迫应答条件下，对作物的一系列生理和细胞功能具有重要作用，而不只是在遭受病虫害后起作用，此基因在半膜覆盖下诱导表达可能在胁迫抗性中扮演重要角色。有趣的是，笔者也鉴定到一个假单胞杆菌属的基因（编号14），更进一步证明了假单胞杆菌是一种与玉米共生的微生物。

此外，还鉴定到另外一些与微生物同源性较高的基因，也可能是与玉米共生有关的微生物。许多研究发现，植物体内外的大量微生物与植物的生长发育及植物的抗性密切相关[22]，并与其邻近生态环境（土壤）有明显区别[23]。

3.3.2 与转录相关基因 在半膜覆盖调控玉米生长发育的过程中，转录过程及相关因子起到关键作用。编号2的片段与玉米锌指蛋白MYM1型的基因高度同源，锌指蛋白是一个庞大的转录因子家族，通过结合锌离子折叠成手指状结构域，其功能主要是调控基因表达[24-25]。在植物中，普遍认为锌指蛋白在非生物胁迫与植物发育方面有重要功能。近年来，许多报道在作物中研究锌指蛋白各种类型的结构和功能，如Xuan N等[26]在玉米中研究了A20/AN1（ZmAN13）型锌指蛋白，在拟南芥中过表达可以提高对冷胁迫的抗性，但同时降低了对盐和干旱胁迫的抗性。但是几乎没有关于MYM型的报道，只有在动物方面的实验。在Catherine M等[27]的研究中报道称，MYM型锌指蛋白是ZNF261和ZNF198（两种小泛素样修饰蛋白）对于结合泛素蛋白是充分必要的。MYM型锌指蛋白还可能具有指导两种蛋白相互作用的功能[28]。

编号10的基因与玉米BCAS2蛋白的基因高度同源，功能可能与mRNA进程相关[29]。BCAS2基因在玉米及其他作物方面的相关研究较少，相关报道集中在动物方面。Nicolai M等[30]在研究人的乳癌细胞中发现，BCAS2基因位于染色体1p13.3-21区且上调表达，预测功能是形成一个核糖核蛋白复合体或者与剪切体相互作用。玉米BCAS2基因在半膜覆盖后下调，可能是通过调控小分子RNA和蛋白复合物的相互作用，这方面的研究还有待于今后的实验。

编号8与玉米翻译起始因子3亚基B（EIF3B）高度同源，EIF3B是一个庞大的多亚基蛋白复合体，具有促进tRNA结合到40S核糖体亚基的功能，通过磷酸化作用频繁地调控翻译过程[31]。此外还有促进细胞凋亡的功能[32]。

4 结论

本研究利用cDNA-AFLP技术对半膜覆盖栽培下的玉米进行基因差异表达研究，采用90对单引物组合检测到2 298条差异片段，其中1 429条为上调表达，869条为下调表达。对成功测序和BLAST比对的15条差异条带进行分析，并按照功能分类将15个差异表达基因分为6类。半膜覆盖调控玉米生长发育的分子机制涉及细胞骨架、能量代谢、转录过程和细胞挽救和防御，以及胞内转运过程协同调控。

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