LDH法测定纤维蛋白胶对人脂肪干细胞的细胞毒性

徐涛　易阳艳

[摘要] 目的 采用LDH法测定纤维蛋白胶对人脂肪干细胞的细胞毒性。 方法 取成人吸脂术后的废弃脂肪组织并从中得到人脂肪干细胞，分别制成50%浸提液组、100%浸提液组、阴性对照组、阳性对照组，并采用LDH检测试剂盒测定各组纤维蛋白培养液中LDH的含量。 结果 原代ASCs生長缓慢，传代后生长加速，且ASCs呈成纤维样细胞形态；24 h和72 h两个时间点中50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤维蛋白胶浸提液组分别与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 纤维蛋白胶对ASCs无明显细胞毒性，可为以纤维蛋白胶为支架材料的脂肪组织工程研究提供参考。

[关键词] LDH法；纤维蛋白胶；脂肪干细胞；细胞毒性

[中图分类号] R622 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）13-0038-03

[Abstract] Objective To determine the cytotoxicity of fibrin glue to human adipose stem cells by LDH method. Methods The abandoned adipose tissue of human liposuction was taken and the human adipose stem cells were obtained and made into the 50% leaching solution group， 100% leaching solution group， negative control group and positive control group.And the LDH test kit was used to detect the content of LDH in each fibrin culture medium. Results The growth of primary ASCs was slow. The growth of ASCs was accelerated after passage， and ASCs appeared fibroblast-like morphology. There was no significant difference between 50% fibrin glue extract group ，100% fibrin glue extract group and the negative control group at 24 and 72 hours（P>0.05）. Conclusion Fibrin glue has no obvious cytotoxicity on ASCs， and it can give a reference to the study of adipose tissue engineering with fibrin glue as scaffold.

[Key words] LDH method； Fibrin glue； Adipose stem cells； Cytotoxicity

软组织缺损是整形外科临床工作中经常遇到的问题，中老年人面部软组织容量减少的矫正也有着广泛需求。目前临床上常用的作为软组织填充的材料可大致分为两类：一类是暂时性填充材料，它们一般是人工合成的机体组织中的正常成分，如透明质酸或胶原蛋白，其因具有生物相容性好、可被降解吸收的优点而应用广泛，但也存在填充效果维持时间短的缺点；另一类是永久性填充材料，它们一般是人工合成的惰性材料组成，如硅胶，其作为软组织填充具有异物植入、效果不自然的缺点[1，2]。自体脂肪颗粒移植近年来发展较快，但移植后的脂肪颗粒的存活尚不理想，导致移植存活率较低，需要多次手术才能达到需要的填充效果[3，4]。近年来，随着脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ASCs）的发现，基于组织再生原理的脂肪组织工程得到了极大发展，以脂肪干细胞为种子细胞的脂肪组织工程研究成为热点[5]。本研究拟采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）法研究纤维蛋白胶对于ASCs的细胞毒性，以期为以纤维蛋白胶为支架材料的脂肪组织工程的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

FBS、低糖DMEM培养基、胰蛋白酶（Gibco）；Ⅰ型胶原酶、纤维蛋白原、凝血酶（Sigma）；乳酸脱氢酶检测试剂盒（南京凯基）。倒置相差显微镜，CO2培养箱，多功能酶标仪（Thermo）。

1.2 人脂肪干细胞的获取

人脂肪干细胞从吸脂术后废弃的脂肪组织中提取，术前已征得患者征得同意，研究经由医院伦理委员会批准。

取成人吸脂术后的废弃脂肪组织5 mL，加入等体积的浓度为1.0 mg/mL的Ⅰ型胶原酶溶液，摇晃混匀后置于水浴箱37℃消化30 min。消化后以1000 r/min的转速离心5 min，去除上层油脂及液体成分。用含有10% FBS的低糖DMEM培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为（5～10）×105个/L，接种至25 cm培养瓶中常规培养。48 h后首次换液，融合至80%左右时用胰蛋白酶消化传代。传至第3代用于后续的实验。

1.3 纤维蛋白胶浸提液的制备

参考ISO 10993医疗器械生物学评价标准，提取纤维蛋白胶浸提液。首先用双联注射器分别吸取等体积的50 mg/mL纤维蛋白原溶液和500 IU/mL凝血酶溶液，均匀注射于6孔板中，使所形成的纤维蛋白胶铺满6孔板底部。待成胶后按照材料表面积/液体体积=3 cm2/mL的标准加入DMEM培养基，37℃孵箱中浸提72 h后获得100%纤维蛋白胶浸提液，将该浸提液加入等体积DMEM培养基稀释获得50%纤维蛋白胶浸提液。将获得的纤维蛋白胶浸提液加入10%的胎牛血清，于4℃保存待后续实验使用。

1.4 LDH检测试剂盒测定各组培养液中LDH的含量

细胞毒性检测分为以下四组：阴性对照组、50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤维蛋白胶浸提液组、阳性对照组（最大酶活性释放对照）。将传至第3代的ASCs胰酶消化后调整细胞浓度为1×107/L的细胞悬液，每孔100 μL接種至96孔板中，培养24 h细胞贴壁后吸弃培养液，按上述分组分别加入以下四种培养液：DMEM培养基（阴性对照组）、50%纤维蛋白胶浸提液、100%纤维蛋白胶浸提液、含6.4%的苯酚的DMEM培养基（阳性对照组）。每组设置复孔5个，共种板2板。然后置于37℃孵箱中培养。分别在孵育24 h、72 h后取出一块96孔板，吸取各孔培养液，1000 r/min离心5 min去除沉淀。使用LDH检测试剂盒按照说明书检测各组培养液中LDH的含量。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS17.0统计学软件进行分析处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脂肪干细胞形态学观察

从人脂肪抽吸物中经酶消化法提取原代ASCs，原代ASCs生长缓慢，约7 d长满培养瓶。传代后生长加速，约3 d左右即可传代。传代后的ASCs形态典型，呈成纤维样细胞形态，有粗大的足突，核仁明显，细胞生长较密时呈明显的漩涡状分布（封三图1）。

2.2 各组培养液中LDH的含量检测结果

各组细胞培养24 h和72 h后的上清液中LDH浓度测定结果显示，24 h和72 h两个时间点中50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤维蛋白胶浸提液组分别与阴性对照组比较，均无显著差异（P>0.05），提示纤维蛋白胶浸提液并不增加ASCs的LDH释放。见表1。

3 讨论

在脂肪组织工程构建中，支架材料是关键的组成部分，组织工程中的支架材料需要满足多个条件，如具有良好的生物相容性、在特定的时间内可以被降解等。纤维蛋白胶（fibrin gel）是模拟凝血反应，纤维蛋白原在凝血酶的作用下形成的具有一定物理强度的胶状物[6]。已经有报道纤维蛋白胶作为支架材料用于多种组织工程的研究中，但是，纤维蛋白胶作为支架材料复合ASCs用于构建组织工程脂肪尚缺乏足够研究[7]。本研究中，我们通过酶消化法从脂肪组织中获取了人的ASCs。通过检测纤维蛋白胶浸提液培养人ASCs后LDH的释放量，评估纤维蛋白胶对于体外培养的ASCs的细胞毒性，结果显示纤维蛋白胶对于ASCs无明显的细胞毒性，为纤维蛋白胶作为支架材料复合ASCs构建组织工程脂肪的深入研究提供参考。

传统的组织工程构建策略是将种子细胞与支架材料复合，经过一定诱导处理之后植入体内，因此，种子细胞和支架材料是其两大关键要素。Zuk PK等[8]在2001年首先报道了在脂肪抽吸物中培养出了具有间充质干细胞特性的细胞种群，命名为ASCs。由于脂肪获取容易以及获取量大，因而从脂肪中获取ASCs具有很好的应用前景。ASCs的发现促进了脂肪组织工程的发展，探索利用ASCs构建出组织工程化的脂肪组织是近年来的热点研究领域[9，10]。

在组织工程中，需要将种子细胞种植于三维支架上，因此，支架材料是影响组织构建的另一个重要因素。根据支架材料的塑形特点，大致可分为预塑形多孔支架材料和可注射性凝胶材料[11]。一般而言，对于脂肪组织工程，可注射型凝胶支架构建的可注射型软组织填充物具有明显优势：手术创伤小；填充均匀，特别是修复不规则缺损效果更好[12]。

纤维蛋白胶是将纤维蛋白原和凝血酶混合，模拟凝血反应的最后通路，纤维蛋白聚合形成水凝胶，通过双联注射器可以很容易实现注射填充。由于纤维蛋白胶具有良好的可降解性能，因而具有作为支架材料用于组织工程中的潜力。已经有报道将纤维蛋白胶用于多个领域的研究，如用于平滑肌、骨、软骨组织工程研究中[13，14]。对于任何需要植入机体的材料而言，其生物相容性是必须要评价的因素。植入材料的生物相容性评价根据国际标准主要分为三个步骤：第一步是体外细胞毒性检测，观察其对于体外培养的细胞的生长增殖的影响，以此来评价其细胞毒性；第二步是动物体内实验，主要用于评价材料对于机体局部和全身的毒性作用；第三步为临床试验。因此，在研究一个材料的生物相容性时，首先要评价的就是其细胞毒性作用。LDH是用于评价细胞毒性的常用指标之一，其在细胞膜受到损伤或者破裂时被释放到细胞外，因而，LDH释放程度就反映了细胞受损程度，其释放越多，细胞损伤越严重[15]。

在本实验中我们分别制备了两种不同浓度的纤维蛋白胶浸提液，即100%浸提液和50%浸提液，并且在培养的第1、3天进行检测，结果显示100%浸提液组和50%浸提液组与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。该结果提示纤维蛋白胶浸提液不影响ASCs的LDH的释放，也就提示纤维蛋白胶对于ASCs无明显细胞毒性。

纤维蛋白胶作为支架材料用于脂肪组织工程尚无足够的研究报道，本研究仅通过LDH法评估了纤维蛋白胶对于体外培养的ASCs的细胞毒性，还需要更多深入而全面的研究来确定纤维蛋白胶作为组织工程支架材料的可行性和安全性。

[参考文献]

[1] Chang Q，Lu F.A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold[J]. Med Hypotheses，2012，79（2）：267-270.

[2] 许兆峰，高建华，李劼，等. 纤维蛋白胶与脂肪来源干细胞影响脂肪注射移植的实验研究[J]. 南方医科大学学报，2009，29（5）：1073-1075.

[3] Eto H，Suga H，Matsumoto D，et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue[J]. Plast Reconstr Surg，2009，124（4）：1087-1097.

[4] Stosich MS，Moioli EK，Wu JK，et al. Bioengineering strategies to generate vascularized soft tissue grafts with sustained shape[J]. Methods，2009，47（2）：116-121.

[5] 张雪莲，马依彤，王常勇，等. 纤维蛋白胶对脂肪干细胞增殖和存活的影响[J]. 中国组织工程研究，2010，14（47）：8747-8750.

[6] Ikari Y，Fujikawa K，Yee KO，et al. Alpha（1）-proteinase inhibitor，alpha（1）-antichymotrypsin，or alpha（2）-macro-globulin is required for vascular smooth muscle cell spreading in three-dimensional fibrin gel[J]. J Biol Chem，2000，275（17）：12799-12805.

[7] 陈晓炜，姜平，高建华，等. 去分化脂肪细胞与脂肪来源干细胞体内成脂能力比较的初步研究[J]. 中華整形外科杂志，2010，26（5）：372-377.

[8] Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al. Multilineage cells from human adipose tissue：Implications for cell-based therapies[J]. Tissue Eng，2001，7（2）：211-228.

[9] 黄艳，易阳艳. MTT法检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响[J]. 中国美容医学杂志，2015，11（5）：37-39.

[10] 阳水发，易阳艳，黄艳，等. 人脂肪干细胞与不同浓度纤维蛋白胶的相容性研究[J]. 重庆医学，2017，46（2）：165-168.

[11] Meinhart J，Fussenegger M，H？觟bling W. Stabilization of fibrin-chondrocyte constructs for cartilage reconstruction[J]. Ann Plast Surg，1999，42（6）：673-678.

[12] 杨震，李波，周焯家，等. 人脂肪干细胞体外培养及细胞载体复合物诱导培养[J]. 中国老年学，2014，3（18）：5187-5190.

[13] 黎洪棉，高建华，吴涛，等. 脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子及纤维蛋白胶复合物体内构建血管化组织工程脂肪[J]. 中国组织工程研究，2011，15（40）：7480-7484.

[14] Tanzi MC，Farè S. Adipose tissue engineering：State of the art， recent advances and innovative approaches[J]. Expert Rev Med Devices，2009，6（5）：533–551.

[15] Luo SH，Xiao W，Wei XJ，et al. In vitro evaluation of cytotoxicity of silver-containing borate bioactive glass[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2010，95（2）：441-448.

（收稿日期：2017-03-14）