高分辨率溶解曲线分析结合COLD-PCR快速检测绵羊低丰度FecB基因

李国忠，陈创夫

（新疆石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000）

高分辨率溶解曲线分析结合COLD-PCR快速检测绵羊低丰度FecB基因

李国忠，陈创夫*

（新疆石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000）

本文利用高分辨率熔解曲线分析结合COLD-PCR建立绵羊骨形态发生蛋白受体IB（BMPR-IB）基因低丰度A746G点突变的检测方法，为FecB基因大面积高通量筛查提供方便快捷和低成本的检测技术。实验分别提取绵羊BMPR-IB基因A746G点突变阳性纯合子和阴性纯合子的基因组，分别PCR扩增223 bp的目的片段，测定浓度和纯度后，分别稀释至0.05 ng/μL，将阳性纯合子用阴性纯合子进行系列稀释作为模板标准品。根据模板标准品序列设计合成3对引物，以标准品为模板进行COLD-PCR，其产物进行高分辨率熔解曲线分析，生成的归一化温度转移差异图（Normlized and Temp-Shifted Differines Plot）即为标准曲线图，作为待测样品FecB检测的依据，对其可靠重复性做了进一步验证。结果表明：2对引物COLD-PCR HRM标准曲线图曲线分离清晰可靠，检测下限均为0.5%，与传统qPCR HRM相比，灵敏度提高到4倍。本实验建立的绵羊低丰度FecB基因检测方法可以用于绵羊FecB基因大面积高通量快速筛查工作。

绵羊；FecB基因；COLD-PCR；高分辨率熔解曲线分析

绵羊产羔率属于阈性状，由多个基因控制。其中，绵羊骨形态发生蛋白受体IB（Bone Morphogenetic Protein Receptor IB, BMPR-IB）基因发生第六外显子A746G单碱基突变后被称作FecB基因，是影响绵羊产羔率的最重要的主效基因，增羔效应最明显，应用最广泛。Davis等[1]报道，一个拷贝的FecB基因能增加 1.3～1.6个卵，双拷贝能增加 2.7～3.0个卵；对于产羔数而言，第1个拷贝能增加窝产羔数0.7～0.9只，第2个拷贝增加0.4～0.5只。

FecB基因不仅是控制我国小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊等多胎绵羊品种的主效基因，而且有的单胎品种也可能有携带FecB的少数个体，孙红霞[2]在宁夏滩羊中检测到低频率的FecB基因。检测出这些携带有FecB基因的羊只留作种用，对提高产羔率有非常重要的意义。目前报道的检测方法有AS-PCR、RFLP-PCR、测序和 HRM等[3-5]。这些方法检测灵敏度较低，一般只用于单只羊的检测，如果用于羊群大面积筛查，则费时费工，成本太高。本研究先通过低变性温度共扩增PCR（Coamplication at Lower Denaturation Temperature PCR，COLD-PCR）对FecB进行有效富集，然后利用高分辨率熔解曲线分析（High Resolution DNA-melting Analysis，HRM）进行快速检测，建立了一种低丰度FecB检测方法，适用于绵羊FecB基因的高通量大面积筛查工作，并快速锁定找到携带有FecB的羊只，以便选种留种之参考。该法方便快捷，准确高效，成本低廉。

1 材料与方法

1.1 实验材料 羊只血液采集于新疆石河子市屠宰场。用事先含有1 mL ACD 抗凝剂的无菌EP管分别收集15只宰杀湖羊和2只宰杀哈萨克羊的静脉血液4 mL，-20℃冻存。

1.2 仪器 Light Cycler®480定量PCR仪，BioDoc -It®Imager System凝胶成像系统，DYY－4C电泳仪，BIO-rad C1000 PCR仪，Eppendorf 5415D超速离心机，Nanodrop 2000分光光度计。

1.3 试剂 通用型柱式基因组提取试剂盒、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和Goadstar DNA Polymerase购自于北京康为世纪公司，PrimeSTAR®HS DNA Polymerase with GC Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，MgCl2购自北京天根生化科技有限公司，LC Green Plus+购自美国Idaho公司。

1.4 基因组的提取 血液基因组的提取按照试剂盒说明进行，用分光光度计测定浓度和纯度，满足实验要求。

1.5 FecB基因检测 首先根据FecB基因序列（GenBank登录号：AF357007.1）设计1对引物，靶向第六外显子，PCR产物长度为179 bp。引物序列：F：5'- GGAAACCCTGAACATCGCTAATAC-3'；R：5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'。分别以提取的各绵羊基因组为模板，用高保真酶进行普通PCR。PCR反应体系 （50 μL）：2×PrimeSTAR GC Buffer（Mg2+plus）25 μL； dNTP Mixture （2.5 mmol/L each） 4 μL；上下游引物（25 umol/L）各0.4 μL；基因组模板1 μL； PrimeSTAR HS DNA Polymerase （2.5 U/μL）0.5 μL；双蒸水补足50 μL。PCR反应程序：95℃ 4 min；98℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 20 s，共35个循环；72℃ 5 min。

最后按照试剂盒操作说明，回收PCR产物，用分光光度计测定纯度和浓度，送生物工程（上海）股份有限公司测序，选取质量良好的FecB阳性纯合子和阴性纯合子基因组，-20℃冻存备用。

1.6 定量PCR标准品模板的制备 首先根据绵羊FecB基因序列，靶向其第六外显子设计合成1对引物223-L/223-R，PCR产物长223 bp，引物序列：223-L：5'-TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA-3'；223-R:5'-AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAAC C-3'。然后分别以经过测序检测为FecB阳性纯合子和阴性纯合子的备用基因组为模板，用高保真酶PCR扩增目的序列。PCR反应体系 ( 50 μL )：2×PrimeSTAR GC Buffer(Mg2+plus) 25 μL ；dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 5 μL ；上下游引物（25 umol/L）各0.5μ L ；基因组模板1 μL； PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.6μL ；双蒸水补足50 μL。PCR反应程序：95℃ 4 min；98℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 20 s，共30个循环；72℃ 5 min。

PCR产物进行凝胶电泳，按照快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作说明，回收223 bp的目的序列，用Nanodrop 2000分光光度计测定纯度和浓度，优先选取纯度最高的回收产物用于后续实验。

最后用灭菌双蒸水将回收的223 bpPCR产物稀释至0.05 ng/μL；然后按照一定的比例混合，使得FecB阳性率分别为100%、50%、25%、20%、15%、10%、5%、2.5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%和0%，作为后续定量PCR的模板标准品。

1.7 引物设计合成 根据标准品模板的序列设计合成3对引物，使FecB基因的A746G突变单碱基位于扩增产物的大概中间位置。引物HPLC纯化。普通PCR检测引物的扩增效率和特异性。引物序列和扩增片段长度见表1。

1.8 qPCR HRM基因分型 用合成的3对引物和100%、50%和0%的模板标准品，进行普通定量PCR结合HRM分型实验。此操作在Light Cycler®480上闭管完成。

1.8.1 qPCR qPCR的体系为：5×Goadstar Buffer 4 μL，超纯dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.2 μL，上下游引物（25 μmol/L ）各0.2 μL，标准品模板0.3 ng，Goadstar Taq Polymerase （5 U/μL）0.2 μL，10xLC Green Plus+ 1 μL，双蒸水补足20 μL。qPCR 反应程序：95℃ 10 min； 95℃ 20 s，退火（表1）25 s（Fluorescence Reading），72℃ 15 s，共35个循环；72℃ 3 min。

表1 普通定量PCR（qPCR）和COLD-PCR引物

1.8.2 HRM 分型 HRM分析程序：95℃ 30 s，40℃ 4 min，65℃ 1 s，90℃（25次Fluorescence Reading/℃），40℃ 1 min。Light Cycler®480 自带软件进行扫描分析，生成Normlized and Temp-Shifted Differienc Plot图，依据该图分型。

1.8.3 qPCR HRM基因分型的灵敏度 100%、50%、25%、20%、10%、5%、2%、1%和0%标准品为模板，用引物Primer1和Primer3进行qPCR HRM基因分型，以检测qPCR HRM的灵敏度。PCR反应体系条件和HRM分析程序同上。

1.9 COLD-PCR HRM检测低丰度FecB基因

1.9.1 COLD-PCR条件的优化 COLD-PCR HRM检测效果受Tc值、Mg2+浓度、杂交时间、荧光染料、模板和引物质量等多方面的影响[6]。本实验Tc值根据前人经验[7]，以Tm-1为基础，在其上下游设定Tc梯度，通过COLD-PCR扩增效率和 HRM分析的效果确定最佳Tc值。Mg2+浓度优化：以qPCR体系含Mg2+浓度分别为1.5、2.0、3.0、3.5 mmol/L，优化最佳浓度。杂交时间设为40 s，2 、4 min 和7 min，进行优化；LC Green Plus+量均为0.5x。

1.9.2 COLD-PCR COLD-PCR体系：和qPCR相同。PCR反应程序：预变性95℃ 10 min； 先运行5个普通PCR循环：95℃ 20 s，退火温度（表1）25 s（Fluorescence Reading），72℃ 15 s；然后35个COLD-PCR循环：95℃ 20 s，68℃ 40 s，Tc温度（表2）20 s ，退火温度（表1）25 s（Fluorescence Reading），72℃ 15 s；72℃ 5 min。

1.9.3 HRM 分析 HRM 分析程序与前面相同。Light Cycler®480自带软件进行Gene Scaning分析，生成FecB基因检测标准曲线图。得到清晰的标准曲线后，重复一次实验，检测其稳定重复性。

2 结果分析

2.1 FecB检测 经测序，15只湖羊中有2只为FecB阳性纯合子，哈萨克羊均为阴性纯合子。选取浓度高纯度高的FecB阳性纯合子和阴性纯合子基因组用于后续实验。

2.2 qPCR HRM分型结果 3对引物的分型图清晰，效果较好（图1）。各基因型PCR产物经测序验证正确无误。qPCR HRM检测下限一般为5%～10%[8]，本实验用引物Primer1和Primer3做了检测灵敏度分析，结果显示，检测下限均为2%（图2）。

2.3 COLD-PCR条件的优化 各对引物PCR产物的Tm值和COLD-PCR最佳Tc值见表2。

经浓度梯度的实验检测，本实验Mg2+的最佳浓度为1.5 mmol/L（Bufffer自带），额外增加Mg2+使扩增效率和特异性均下降；早期报道的COLDPCR异源双链杂交时间一般为数分钟，近年，有研究用PhusionTMHigh-fidelity Polymerase或HotStar Taq DNA Polymerase等酶及其Buffer，最佳杂交时间降为30 s[9-11]，这可能和所使用的试剂有关。本实验最佳杂交时间为40 s，如果延长时间则PCR特异性下降，熔解峰图凌乱，这可能与Buffer组成等有关，降低了杂交所需必要时间。

表2 2对引物PCR产物的Tm值和COLD-PCR的 Tc值 ℃

2.4 COLD-PCR HRM检测结果 用Primer1和Primer2引物以及优化的最佳条件进行COLDPCR HRM分析，结果见图3（a和b、c和d、），COLD-PCR HRM检测灵敏度均为0.5%，与传统定量PCR HRM相比，灵敏度提高到4倍。用Primer1引物进行的独立重复实验（图3 e和f）表明，得到的标准曲线具有重复稳定性。

3 讨 论

本实验建立的qPCR HRM方法，适用于检测单只或少数羊只混合样品的FecB情况；建立的COLD-PCR HRM低丰度检测方法，除此之外，还适用于大面积高通量筛查工作。本文2对引物的COLD-PCR HRM检测方法，灵敏度均为0.5%。羊为二倍体，所以，如果将每只羊的基因组等量混合制作混合池，以此作为模板，1个PCR反应样孔1次最多检测100只羊。按此计算，如果用96孔板，一次PCR反应即可完成数千甚至近万只羊FecB总频率的检测，非常方便快捷，而且成本低廉。如果想要在阳性混合样本中，找出到底哪只或哪些羊只携带有FecB，可以将样本分成若干组，每组再检测一次，缩小范围，这样，可以快速锁定并找出阳性个体，最后测序验证。另外，经独立实验验证，所建立的标准曲线图具有重复稳定性，这为FecB基因

选种育种带来便利。

图1 qPCR HRM 分型结果

本实验中，与传统PCR相比，COLD-PCR将高分辨率熔解曲线分析的灵敏度提高到4倍。COLD-PCR对反应孔温的精确控制有很高要求，而本实验所用定量PCR仪温度设置只能设整数值，所以最佳Tc的摸索和设定受到了限制，有可能限制了突变富集的程度。 Milbury等[10]在COLD-PCR的基础上，建立了ice-COLD-PCR；Kit等[11]进一步发展了ice-COLD-PCR，提出了E-ice-COLDPCR的方法，降低了对定量PCR仪控温性能的要求，并提高了突变富集程度[12-13]。但这些方法下游结合HRM检测的技术还未见报道。

图3 COLD-PCR HRM检测结果

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S826.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-122

2016-12-07；

2017-04-25

李国忠（1968-），男，新疆石河子人，博士研究生，主要从事动物转基因研究，E-mail: lgz8791@163.com

* 通讯作者：陈创夫（1964-），男，教授，博士生导师，主要从事病原微生物分子机制研究，E-mail: ccf－xb@ 163.com

图2 qPCR HRM检测灵敏度