乳酸菌发酵黄芪多糖制剂在肉鸡生产上的应用

王 涛，樊克锋，汤法银*，王坤丽

（1.河南牧业经济学院动物医学院，河南郑州 450046；2.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450046）

乳酸菌发酵黄芪多糖制剂在肉鸡生产上的应用

王 涛1，樊克锋1，汤法银1*，王坤丽2

（1.河南牧业经济学院动物医学院，河南郑州 450046；2.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450046）

本试验旨在研究一种乳酸菌发酵的黄芪多糖（APS）制剂及其对肉鸡生长性能、血清免疫球蛋白IgG、IgA含量及肠道菌群的影响。首先提取APS，测定乳酸菌对其发酵的可能性，确定最适宜的添加量；其次选择500只1日龄体重相近的健康AA＋肉仔鸡，随机分为5组，每组100只。Ⅰ组为对照组，饲喂基础日粮，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组分别在基础日粮中添加20% APS 0.1 ɡ/kg和0.1、0.2、0.3 mL/kg的乳酸菌发酵制剂。试验期为6周。结果表明：乳酸菌在添加20% APS的液体培养基中生长最优；与对照组相比，试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组肉鸡的生长性能显著提高（P＜0.05），其中以Ⅳ组效果最好；与对照组相比，试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组肉鸡血清IgG、IgA含量显著提高（P＜0.05），试验组肉鸡肠道微生物体系均有改善，盲肠大肠杆菌数量显著降低（P＜0.05），盲肠乳酸菌数量显著升高（P＜0.05）。综合考虑，肉鸡日粮中乳酸菌发酵APS制剂的最佳添加量为0.2 mL/kg。

乳酸菌；黄芪多糖；生长性能；IgG；IgA；肠道菌群

乳酸菌是一类能发酵碳水化合物、产生乳酸的革兰氏阳性菌的总称，具有抗菌、维持肠道菌群平衡、促进营养物质吸收、增免等多种功能[1]。黄芪为常用补气中药，性微温、味甘，含多糖、皂甙、氨基酸等多种有效成分，具有提高动物生产性能，增强机体免疫力等作用[2]。黄芪多糖（Astragalus Polysacharin，APS）是黄芪中发挥作用的主要成分，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗应激等作用。本研究利用乳酸菌发酵APS，以乳酸菌活菌数为指标，选择APS的合适添加量，制成发酵制剂，并研究其对肉鸡生长性能、血清免疫球蛋白含量及肠道菌群的影响，为生产应用提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 主要材料 乳酸菌菌种由河南牧业经济学院益生菌发酵中药实验室提供；试验用黄芪购于郑州国药大药房；MRS培养基、无水乙醇、IgG和IgA试剂盒均购于试剂公司。

1.1.2 主要仪器 精宏DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱（上海）；赛多利斯BSA124S电子天平（德国）；申安LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器（上海）；印溪DHP-9272电热恒温培养箱（上海）；鑫天XSP91-06E-1电光源显微镜（上海）。

1.2 试验设计与饲养管理 本试验采用单因子随机试验设计，将体重相近的500只1日龄AA＋肉仔鸡，随机分为5组，每组100只。Ⅰ组为对照组，饲喂基础日粮（表1），Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组为试验组，饲喂基础日粮的基础上分别添加20%APS 0.1 ɡ/kg和0.1、0.2、0.3 mL/kg的乳酸菌发酵制剂。试验期为6周。1～2周为每笼50只，3～4周为每笼20只，5～6周为每笼10只。本试验在河南牧业经济学院试验基地进行，试验鸡各组分笼饲养，做好标记，全程自由采食和自由饮水。严格控制鸡舍内的光照、温度和湿度，定期消毒、免疫。详细记录各指标。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化 从-20℃冰箱取出冻存的屎肠球菌和植乳杆菌菌种，分别接入已灭菌的MRS液体培养基中，37℃培养24 h。然后将2种菌分别以5%的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养24 h，镜检。等量混合即得发酵所用的混合液体菌种。

1.3.2 APS的制备 称取适量黄芪，浸泡1～2 h，加入5倍中药重量的水，大火煎开，沸腾后文火煎煮50 min，真空抽滤，药渣与药液分离。将药渣重复以上步骤再煎第2次、第3次，合并3次滤液，4 200 r/min离心15 min，弃沉淀，浓缩上清液至1 g/mL。取浓缩液适量，加3倍95%的乙醇，静置过夜，离心，将沉淀置于60℃烘干，称重。研成粉末备用。

1.3.3 APS添加量及发酵条件的确定 本试验采用液体发酵，试验组APS添加量分别为10%、20%、30%、40%、50%，以不加APS的MRS培养基为对照。调节各组培养基pH为7，灭菌后按1%的接种量接种，37℃培养36 h。测定乳酸菌的活菌含量。

1.3.4 乳酸菌活菌计数 吸取1 mL样品匀液于9 mL生理盐水的试管中，震荡，制成1:10的样品匀液，按上述操作依此倍比稀释至合适浓度。选择2～3个合适稀释度，用无菌移液管分别吸取每个稀释度0.1 mL到2个MRS琼脂平板上，涂匀，倒置于37℃培养箱中培养（24±2） h。

表1 基础日粮组成及营养成分（干物质基础）

每毫升样品中菌落数=平板上菌落数×稀释倍数/平板中菌液添加量

1.4 肉鸡不同指标的测定

1.4.1 生长性能指标测定 根据每天记录的耗料量计算平均日采食量。第21、42天对各组鸡空腹称重，计算平均日增重。记录肉鸡阶段的耗料量和阶段的体增重，两者之比为耗料增重比。

1.4.2 免疫指标的测定 分别在21 、42 d时，每组随机选取3只鸡采血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存，测定血清IgG、IgA的含量。

1.4.3 肉鸡肠道微生物菌群测定 第42天时解剖鸡，结扎肠道，无菌取空回肠部分内容物1 g，置于9 mL生理盐水的试管中，震荡、3 000×g离心10 min，上清液倍比稀释。取合适梯度的菌液分别接种于LB、MRS培养基培养，计算大肠杆菌和乳酸杆菌菌落数。

1.5 统计分析 数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan's多重比较，P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。试验数据用平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 APS添加量的确定 乳酸菌可以在APS液体培养基中生长，且随着APS添加量的增加，乳酸菌活菌数先升高后降低。当APS添加量为20%时，乳酸菌活菌数达到最高，达到22.72×108CFU/g。

2.2 乳酸菌发酵APS对肉仔鸡生长性能的影响 由表2可知，在0～3、4～6、0～6周龄试验组肉鸡的增重与对照组相比差异显著（P＜0.05），其中Ⅴ组（高剂量组）增重最明显。0～3周龄Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组肉鸡的耗料增重比显著低于对照组（P＜0.05）；4～6周龄Ⅴ组肉鸡的耗料增重比显著低于对照组（P＜0.05）；0～6周龄Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组肉鸡的耗料增重比显著低于对照组（P＜0.05），Ⅱ组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

2.3 乳酸菌发酵APS对肉仔鸡免疫功能的影响 由表3可知，在21 d，各试验组肉鸡血清IgG的含量较对照组显著提高（P＜0.05），其中Ⅳ组含量最高，但与Ⅴ组相比差异不显著（P＞0.05）。在42 d，Ⅴ组血清IgG含量最高，较对照组提高了25.87%（P＜0.05）；总体来看，发酵制剂添加量增加时，肉鸡血清IgG的含量随之增加，前期Ⅳ组最高，后期Ⅴ组最高，综合考虑添加中剂量更合适。在21 d时，试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组肉鸡血清IgA含量较对照组分别提高了33.3%、52.5%、59.6%（P＜0.05）；Ⅱ组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。在42 d，各试验组血清IgA含量与对照组差异显著（P＜0.05），其中Ⅴ组含量最高，但与Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。

2.4 乳酸菌发酵APS对肉仔鸡肠道菌群的影响 由表4可知，各试验组肉鸡的回肠大肠杆菌数量均在一定程度上低于对照组，随着发酵制剂添加剂量的增大，肉鸡回肠大肠杆菌数量递减，且各组之间差异显著（P＜0.05）。试验组肉鸡肠道乳酸菌数量均高于对照组（P＜0.05），其中Ⅴ组乳酸菌数量最高，但其与Ⅳ组相比差异不显著（P＞0.05）。

3 讨 论

3.1 乳酸菌发酵APS对肉仔鸡生长性能的影响 APS及益生菌发酵后制剂可提高动物生产性能已经得到证实，在不同的试验动物和试验条件下，结果略有不同，但总的趋势一致。李树鹏[3]在基础日粮中分别添加APS、益生菌剂以及多糖与益生菌制剂复合，结果显示各组均能显著提高雏鸡的生长性能，其中多糖与益生菌制剂复合效果最优，这与本试验中在基础日粮的基础上添加APS乳酸菌发酵制剂能够增加肉鸡日增重、降低耗料增重比的结果一致。因此，日粮中添加APS益生菌发酵制剂可以提高肉仔鸡平均日增重，降低耗料增重比，对肉仔鸡的生长性能有显著促进作用。

3.2 乳酸菌发酵APS对肉仔鸡免疫功能的影响 免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE 5类，主要参与体液免疫，IgG和IgA发挥主要作用。乳酸菌可以激活特异性免疫应答，提高IgG、IgA、IgM的水平，增强体液免疫，促进B细胞、T细胞的增殖，提高细胞免疫[4]。Zhu等[5]研究表明，低剂量的灵芝多糖处理对提高免疫抑制小鼠的免疫效应细胞的活性有很大影响。赵天章等[6]发现在日粮中添加APS可提高肉鸡血清IgG、IgM与IgA浓度，尤其对IgG的促进作用更大。本试验研究表明，日粮中添加一定量的乳酸菌发酵APS制剂，可以提高肉仔鸡血清IgG、IgA含量，进而增强机体免疫功能。3.3 乳酸菌发酵APS对肉仔鸡肠道菌群的影响 肠道微生态环境的稳定是维持机体健康和预防疾病的重要因素，肠道菌群一旦失调，势必影响机体健康[7]。APS具有调整肠道微生态失调的作用，促进肠道有益菌的增殖。乳酸菌是肠道正常的优势菌群，通过与致病菌竞争来抑制其繁殖；同时刺激肠道的蠕动，促进粪便排出[8]。梁金花等[9]研究表明，APS对大鼠溃疡性结肠炎作用明显，治疗7 d后，肠道菌群恢复正常。玄家洁[10]研究表明，乳酸菌复合物对大肠杆菌的体外联合抑制作用明显，肉鸡肠道菌群恢复正常。日粮中添加不同益生菌对菌群种类和数量都产生了不同程度的影响，这与菌群种类和宿主肠道物质代谢都息息相关。本试验表明，乳酸菌发酵制剂对肠道菌群的平衡有促进作用，可降低回肠大肠杆菌数，增加肠道乳酸菌数量。

表2 发酵制剂对0~6周肉仔鸡生长性能的影响

表3 发酵制剂对肉鸡血清免疫球蛋白的影响 mg/L

表4 发酵制剂对肉鸡回肠乳酸菌和大肠杆菌数量的的影响

4 结 论

本试验结果表明，乳酸菌可以在APS液体培养基中生长，APS最适添加量为20%。日粮中添加发酵制剂对肉仔鸡的生长性能有显著促进作用，其中以Ⅳ组（20% APS+乳酸菌发酵制剂0.2 mL/kg+基础日粮）效果最好；日粮中添加发酵制剂可以提高肉仔鸡血清中IgG、IgA的含量，进而增强机体免疫功能；日粮中添加发酵制剂可以改善肉鸡肠道微生物体系，减少肠道大肠杆菌数量，并促进乳酸菌的定殖，对肠道菌群的平衡发挥重大作用。

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Studies on Application of Astragalus Polysacharin Fermented by Lactic Acid Bacteria In Broilers

WANG Tao1, FAN Ke-feng1, TANG Fa-yin1*, WANG Kun-li2
(1.College of Veterinary Medicine, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Henan Zhengzhou 450046, China; 2.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Henan Zhengzhou 450046, China)

This study was aimed to prepare of a kind of Astragalus Polysacharin(APS) which fermented by lactic acid and research its influence on the growth of broiler, serum immunoglobulin levels and intestinal flora. Firstly, the preparation of APS, as well as the feasibility of fermenting Astragalus using lactic acid bacteria was determined and the best optimum adding amount. Secondly, 500 1-day-old AA＋broilers were randomly divided into 5groups. Chickens in the control group were fed basal diet, while chickens in the test groups, based upon the basal diet, were added with 0.1 g/kg of the 20% APS and 0.1、0.2、0.3 mL/kg of preparation which fermented by lactic acid. And the experiment lasted for 6 weeks. The results showed that 20% APS has better growth-promoting effects to the lactic acid . During the whole test period, compared with control group, groups Ⅲ, Ⅳ and V was significantly improved the growth performance of broilers (P＜0.05), as well as group Ⅳ was the best; Compared with control group, groups Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and V was significantly improved the content of IgG and IgA (P＜0.05), groups Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and V could make the intestinal micro environment better, reduce the number of E.coli in cecum, and increase the number of Lactobacillus in broilers and the effect was significant(P＜0.05). In conclusion, based upon the basal diet, the best addition amount of the preparation which fermented by lactic acid was 0.2mL/kg.

Lactic acid bacteria; Astragalus polysacharin; Growth performance; IgG; IgA; Intestinal bacterial

S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-102

2017-01-06；

2017-05-15

省骨干教师项目（2013GGJS-191）；自然科学研究项目（12A23000）

王涛（1971-），男，讲师，硕士，研究方向为畜禽寄生虫病防制，E-mail：153090502@qq.com

* 通讯作者：汤法银（1977-），男，副教授，硕士，研究方向为中兽药研究开发与应用，E-mail：finetang@126.com