大白猪NCOA1和FUT1基因多态性与繁殖性能的关联分析

李 涛，黄 涛*，胡九英，汪德明，鲁慧文，孙敬礼，李卫忠，来红霞

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.新疆正大食品有限公司,新疆五家渠 831301）

大白猪NCOA1和FUT1基因多态性与繁殖性能的关联分析

李 涛1，黄 涛1*，胡九英2，汪德明2，鲁慧文1，孙敬礼1，李卫忠1，来红霞2

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.新疆正大食品有限公司,新疆五家渠 831301）

本研究利用PCR-RFLP技术检测685头大白母猪NCOA1和FUT1基因多态性并对其分型，同时分析了单个基因型以及合并基因型与母猪繁殖性能的关联性。结果表明：2个基因都检测到了3种基因型；经产母猪NCOA1基因中AB型个体的总产仔数、总活仔数、死胎显著高于AA型个体（P＜0.05）；经产母猪FUT1基因中AA型个体的总产仔数、总活仔数、健仔数以及初生窝重显著高于AG型和GG型个体（P＜0.05）；经产母猪合并基因AAAA型和ABAG型个体的总产仔数、总活仔数、健仔数显著高于AAAG型个体（P＜0.05），ABAG型个体的死胎显著高于AAAG型个体（P＜0.05），AAAA型个体的初生窝重显著高于AAAG和AAGG型个体（P＜0.05）。由此可见，NCOA1和FUT1单基因型以及合并基因型对繁殖性能具有一定的影响，可以用其作为遗传标记辅助选择。

猪；NCOA1基因；FUT1基因；合并基因型；繁殖性能

猪的繁殖性状是一个重要的经济性状，其繁殖性能高低对猪场的经济效益起着决定性作用。由于繁殖性状的低遗传力，常规育种进展缓慢。标记辅助选择法（Marker-assisted Selection，MAS）为猪繁殖性状的选育提供了一种新的方法，基于对候选基因的分子标记，筛选出生产性能高且繁殖性能强的母猪，可以大大提高猪的繁殖性能[1]。

断奶仔猪易患腹泻和水肿病，是引起断奶仔猪死亡的重要病因。该病是由肠毒素型大肠杆菌F18（ETECF18）引起，其是否致病取决于猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘有无相关受体。岩藻糖转移酶基因（Fucosyltransferase Gene，FUT1）第307位碱基突变（G→A）,产生2种等位基因G和A,基因型GG和AG的个体均为断奶仔猪腹泻和仔猪水肿病易感型,基因型AA为抗性型,并认为可将FUT1点突变作为断奶仔猪腹泻和仔猪水肿病的一个遗传标记[2]。Gogeli等[3]研究发现，其位于猪6号染色体上的2α-（1,2） FUT1是猪ETEC F18受体蛋白基因，该基因与母猪的产仔性能具有密切的相关性。晏学明等[4]、包文斌等[5]采用PCR- RFLP方法，在FUT1基因M307位点经Hin6 I酶切后，均有AA、AG和GG 3种基因型出现。

核受体辅激活蛋白1基因（Nuclear Receptor Coactivator 1 Gene，NCOA1），又称为类固醇受体辅激活蛋白基因，是猪繁殖性能候选基因之一，其作用机制是与DNA上核受体相结合来增强其转录活性[6]。Melville等[7]根据人和猪基因的同源性设计引物，采用PCR-RFLP方法，分析了猪NCOA1基因的多态性与繁殖性状的关系，进行测序发现梅山猪存在一个T/C单核苷酸多态性。Razeto等[8]还提出NCOA1基因是生殖激素“开关”的观点，认为生殖激素长时间打开可能是导致猪窝产仔数增加的原因。

NCOA1和FUT1在繁殖性状上起着重要作用，但不同研究者报道的结果不一致。新疆地区对母猪繁殖性状分子标记还缺乏比较系统的研究，尤其是合并基因型的相关研究较少，鉴于两基因在繁殖性状上的重要作用，本实验采用PCR-RFLP方法分析大白猪NCOA1和FUT1基因的多态性，分析单基因型和合并基因型与繁殖性能的关系，旨在为新疆地区猪的分子育种积累数据，为繁殖性状的分子标记辅助选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 统计2014—2016年新疆正大食品有限公司685头经产、初产大白母猪6胎共2 849胎次的总产仔数（TNB）、总活仔数（NBA）、健仔数（NHB）、死胎、木乃伊胎以及初生窝重等信息，其中初产685胎。采集685头大白猪耳组织样，浸泡在75%酒精溶液中。

1.2 实验试剂、仪器 实验仪器包括RT-PCR仪、DYY-4稳流稳压电泳仪、台式恒温振荡器、Gel DocTM XR电泳凝胶成像系统、微波炉、台式高速离心机。

试剂包括琼脂糖、Marker DL2000、血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒（购自TIANGEN公司）；DNA限制性内切酶RsaⅠ、HhaⅠ购自TaKaRa-宝生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA的提取 取猪耳组织样100 mg于EP管中剪碎，提取按照TIANGEN基因组DNA提取试剂盒说明书进行，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，用Nano 2000测定DNA浓度，并稀释至50 ng/μL，-20℃保存，用于后续实验。

1.3.2 引物 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

1.3.3 PCR扩增 反应体系15 μL：2×Es Taq Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，去离子水6.2 μL。NCOA1反应条件：94℃变性4 min，35次循环（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s），72℃延伸5 min，4℃，1 h；FUT1反应条件相同，退火温度为57℃；PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4 PCR-RFLP检测 NCOA1和FUT1分别用限制性内切酶Rsa、HhaⅠ进行酶切。酶切反应体系：PCR产物13 μL，内切酶0.5 μL，10×Buffer 1.5 μL，37℃水浴3 h，酶切产物用2.0%的琼脂糖电泳检测分型，利用凝胶成像系统拍照，判断基因型。

1.4 统计分析 对基因频率和基因型频率分别进行统计分析，同时计算多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（NE）、遗传杂合度（He）和遗传纯合度（Ho）[9-10]。建立最小二乘法分析模型，利用SAS（Version9.1）软件分别对实验猪群多态位点的单基因型、合并基因型与繁殖性状进行关联性分析，并进行H-W检验。统计分析模型：

其中，y为繁殖性状（TNB、NBA、NHB）的观察值；μ为群体的均值；Bi为胎次效应；Sj为季节效应；Gk为年度效应；eijkl为随机残差。

2 结果与分析

2.1.1 NCOA1多态性分析 NCOA1基因PCR产物为440 bp，经限制性内切酶RsaⅠ酶切后用2.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测到3 种基因型（图1）：440、440/282/158、282/158 bp，分别命名为AA、AB和BB型。

图1 NCOA1基因扩增产物PCR-RFLP电泳图

2.1.2 FUT1多态性分析 FUT1基因PCR产物为328 bp，经HhaⅠ酶切后用2%的琼脂糖凝胶电泳检测到3种带型（图2）：328/93、328/241/93/87、对初产母猪繁殖性状的影响 由表4可知，初产母猪BB基因型个体数小于2，表中不对BB基因型以及其合并基因型作分析。初产母猪NCOA1基因中AB型个体的各繁殖性状呈现出高于AA型个体的趋势，而木乃伊胎与其相反；初产母猪FUT1基因中AG型个体的TNB、NHB、初生窝重呈现出高于AA型和GG型，而在NBA、死胎、木乃伊胎分布趋势则不尽相同；两基因均未达到差异显著水平（P 241/93/87 bp，分别为AA、AG和GG基因型。

表1 PCR引物序列

2.2 大白猪NCOA1、FUT1基因基因遗传多态性分析

2.2.1 等位基因频率、基因型频率以及遗传特性分析 由表2可知，NCOA1基因BB型个体数小于2，所以在后续分析中只对AA和AB基因型进行分析；NCOA1基因型频率呈现出AA＞AB＞BB，AA为优势基因型；等位基因频率A＞B，A为优势等位基因。由表3可知，FUT1其基因型频率趋势为GG＞AG＞AA，GG为优势基因型；等位基因频率G＞A，G为优势等位基因；NCOA1的He为0.13，FUT1的He为0.29，NE分别为1.15和1.41；PIC均小于0.25，说明此群体处于低度多态；χ20.05值均小于5.99，说明此群体处于H-W平衡（P＞0.05）。

2.2.2 基因效应分析 由表3可见，NCOA1基因在经产母猪中表现出正的加性效应，而FUT1则相反；NCOA1和FUT1基因在经产母猪中都表现出负的显性效应；在NCOA1基因中，A等位基因在初产母猪中NBA、NHB具有负效应，而B等位基因则相反；B等位基因对经产母猪TNB、NBA、NHB具有正效应；在FUT1基因中，A等位基在初产母猪中对TNB有负效应，对NBA和NHB有正效应，经产母猪中为负效应；G等位基因在初产母猪中表现出负效应，在经产母猪中则相反。

2.3 NCOA1和FUT1单个基因型以及合并基因型＞0.05）；初产母猪合并基因型中各基因型之间均未达到显著水平（P＞0.05），但ABAA基因型的TNB、NBA、NHB以及死胎高于其他基因型，合并基因型的各项指标均优于单基因型。

图2FUT1基因扩增产物PCR-RFLP电泳图

表2NCOA1和FUT1基因型频率及等位基因频率分布

表3NCOA1和FUT1的基因效应

2.4 NCOA1和FUT1单个基因以及合并基因型对经产母猪繁殖性状的影响 由表5可见，经产母猪合并基因型应为9种，但由于BB基因型个体数较少，表中只列出7种。经产母猪NCOA1基因AB型个体的TNB、NBA、死胎显著高于AA型个体（P＜0.05），AB型个体的TNB、NBA、死胎比AA型分别多0.49、0.37、0.11头；经产母猪FUT1基因AA型个体的TNB、NBA、NHB以及初生窝重显著高于AG型和GG型（P＜0.05），AA型的TNB比AG型和GG型多1.15、1.06头，NBA多1.23、1.11头，NHB多1.15、1.01头，初生窝重重多1.64、1.35 kg；合并基因型AAAA型和ABAG型的TNB、NHB与AAAG型差异显著（P＜0.05）；AAAA型个体的NBA比AAAG高1.19头（P＜0.05）；ABAG型个体的死胎显著高于AAAG型（P＜0.05）；AAAA型个体的初生窝重显著高于AAAG和AAGG型个体（P＜0.05）。

表4NCOA1和FUT1不同基因型对初产母猪繁殖性状的影响

表5NCOA1和FUT1不同基因型对经产母猪繁殖性状的影响

3 讨 论

繁殖性能与猪场的经济效益息息相关，常规的育种技术使猪的许多生产性状得到了改变，但对产仔数等低遗传力的性状改变却很低。核受体辅激活蛋白的作用是通过其结合DNA上的核受体相互作用并增强转录活性。组蛋白乙酞基转移酶的活性诱使辅激活蛋白增强核受体的转录活性，而且可以提供结合位点而形成稳定的起始前复合物[11]。因此，NCOA1蛋白可以调节与猪繁殖性状有关基因的转录，从而影响这些基因的表达，进而影响猪的生产情况。FUT1基因型为AA型的猪能够抗大肠杆菌F18（ETECF18）的侵染，而AG型与GG型的猪对ETECF18易感。因此，研究探讨其合并基因型对产仔数影响的遗传效应将更有利于利用标记辅助选择对猪种进行遗传改良。

本研究以685头大白猪6胎共2 849胎次为实验群体，样本含量及分布符合统计学要求，群体处于H-W平衡、低度多态（PIC＜0.25），2种基因均存在多态性。NCOA1、FUT1单基因型以及合并基因型遗传特性，在所检测群体中，NCOA1和FUT1基因有AA、AB、BB以及AA、AG、GG基因型。NCOA1、FUT1基因所测得基因型频率、基因频率分布与施启顺等[12]、张新银等[13]报道结果一致。鲁慧文等[14]研究结果表明，NCOA1基因在产仔数和窝产NBA上出现AA＞AB＞BB；任广志等[15]研究表明，豫南黑猪在TNB、NBA上呈现AA＞AB＞BB趋势。本研究结果表明，经产母猪NCOA1基因型AA型与AB型之间TNB、NBA、NHB差异显著,且AB高于AA；本研究结果与其不一致，这可能是因为环境效应，季节效应以及胎次效应等因素造成，另外饲养条件以及妊娠管理不当也可造成此结果。包文斌[16]对猪FUT1基因多态性与产仔性能进行了关联分析，发现AA型个体产仔数高于GG和AG型个体，本研究中经产母猪产仔数与其报道结果一致。

NCOA1和FUT1合并基因型分析报道还未见定论。本研究分析合并基因型后发现，经产母猪中由2个优良基因型合并后的ABAA仍为最优基因型；ABAA型个体的TNB、NBA以及NHB最高；其中AAAA与AAAG在TNB、NBA、NHB以及初生窝重差异显著，AAAG与ABAG在TNB、NHB差异显著且ABAG显著高于AAAG，而在两基因的死胎却是AAAG显著高于ABAG，AAAA和AAGG之间差异显著,且AAAA显著高于AAAGG，从上述结果中可以看出合并基因型的效应明显高于单基因效应[17]。

分析结果表明，初产母猪的合并基因型的TNB、NBA、NHB以及初生窝重的生产性能要高于单基因型，而在死胎和木乃伊胎则表现为相对单基因型较低的水平；经产母猪也表现为相同的趋势，而且经产母猪在各项生产指标均优于初产母猪，以合并基因型AAAA型在各项生产指标中表现为优于单基因型。

本研究从遗传效应、单基因型和合并基因型分析探讨NCOA1和FUT1与繁殖性能的关系，结果表明NCOA1和FUT1作为标记辅助育种的候选基因对猪的繁殖性能有着重要的影响，可用于分子育种。

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S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-058

2016-10-12；

2016-12-29

国家国际科技合作项目（2014DFA31840）；石河子大学动植物育种专项（gxjs2013-yz06）

李涛（1990-），男，新疆五家渠人，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：982674883@qq.com

* 通讯作者：黄涛（1978-），男，湖北随州人，博士，副教授，研究方向为猪分子育种，E-mail：taohuang@sina.com