miR-let-7基因家族在金华猪和长白猪中的组织表达分析

高慧珍，陈理星，董定娟，高甜甜，黄敏婕，徐宁迎

（浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058）

miR-let-7基因家族在金华猪和长白猪中的组织表达分析

高慧珍，陈理星，董定娟，高甜甜，黄敏婕，徐宁迎*

（浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058）

miR-let-7基因广泛参与动物组织器官的发育调控，其表达具有组织特异性。本研究选用70 d的金华猪和长白猪公猪（各3头），采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测了let-7基因家族6个成员（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在心脏、肝、脾、肺、肾、小肠中的表达量，分析它们在组织间及品种间的表达差异，重点分析了在小肠中的表达差异。结果表明：let-7基因家族在长白猪肝组织中表达量显著高于其他组织（P＜0.05），在金华猪小肠和心脏中显著高于其他组织（P＜0.05）；在小肠中，金华猪let-7a和let-7c基因表达量极显著高于其他成员（P＜0.01），长白猪let-7a基因表达量极显著高于其他成员（P＜0.01），let-7在小肠的表达存在品种间差异，金华猪的let-7a和let-7d-3p基因表达量极显著高于长白猪（P＜0.01），let-7c基因显著高于长白猪（P＜0.05），而let-7e基因却显著低于长白猪（P＜0.05）。本研究结果为探究miR-let-7基因在金华猪和长白猪生长和脂肪形成方面的分子作用机制提供了参考。

miR-let-7；基因相对表达量；组织表达；小肠；猪

microRNA（miRNA）介导的调控方式是基因表达调控机制中不可或缺的重要组成部分。通过对miRNA的研究发现，基因组的非组蛋白编码区蕴藏着重要的生命功能活动信息，miRNA参与调控哺乳动物一系列的生物学过程，包括发育和衰老及死亡的时序调控[1]、肌细胞分化[2]、脂肪代谢和脂肪细胞分化[3]、脑及神经发育[4]、心脏发育[5]等。miR-let-7基因最早是在线虫中发现，是线虫发育的时间调控器[6]，被认为是miRNA的代表。miR-let-7基因可以促进成年动物体内脂肪细胞[7]、心肌细胞[8]以及肝脏和卵巢的发育，对青春期的时序和体型的调控有着重要的影响[9]。对miRNA调控机制的研究为动物生长及品质调控分子机制的研究奠定了基础，对调控动物肌肉和脂肪组织生长发育和肉品质等性状具有重要意义。金华猪是我国著名的优良地方猪种之一，主要分布在浙江省，头部和尾部呈黑色，中间体部为白色，又称“两头乌”，具有肉质好、皮薄骨细、性成熟早、繁殖率高等优点，常被用于腌制优质火腿。长白猪又名兰德瑞斯猪，原产于丹麦，体躯长，被毛白色，是典型的瘦肉型猪种，具有生长快、体形大、产仔多、饲料利用率高等优点。金华猪和长白猪在生长速度、肌内脂肪含量等方面存在着极大的差异。猪的脂肪消化和吸收主要在小肠，脂肪合成主要在肝脏。本研究通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析比较金华猪和长白猪肝脏、小肠及其他组织中miR-let-7基因的表达，为进一步研究miRNA在猪的生长发育过程中对生长速度和脂肪合成发挥的调控作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取相同饲养条件下70 d的金华猪和长白猪公猪（各3头），体重在（8.87±0.09）kg。采集心脏、肝、脾、肺、肾、小肠组织，每个部位取3个重复样品，立即投入液氮中速冻，-80℃冷冻保存备用。

1.2 试剂与仪器 荧光定量PCR仪为Step one plusPCR System(ABI)，NanoDrop2000c核酸分析仪，引物序列由上海Invitrogen公司合成。Trizol法提取总RNA，miRcute miRNA cDNA第1链合成试剂盒（TIANGEN，北京），miRcute Plus miRNA qPCR 检测试剂盒（TIANGEN，北京）。

1.3 RNA的提取及反转录 用Trizol试剂提取组织总RNA，用NanoDrop2000c核酸分析仪检测RNA浓度和纯度，OD260/280均在1.8～2.0，RNA浓度和纯度都符合用miRcute miRNA cDNA第1链合成试剂盒反转录的要求。

1.4 实时荧光定量PCR 用反转录的cDNA按照miRcute Plus miRNA qPCR 试剂盒说明书利用通用引物和特定的miRNA引物在Step one plus （PCR System(ABI)）仪器上进行反应。反应体系：2× miRcute Plus miRNA Premix（含SYBR, 含ROX）10 μL， 上、下游引物 （10 μmol/L）各0.4 μL，miRNA第1链cDNA 2 μL，50× ROX Reference Dye 2 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：95℃起始模板变性 15 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40个循环。引物序列见表1。

1.5 统计分析 本研究采用相对实时荧光定量qRT-PCR 法，内参引物为Met-tRNA。采用2-ΔΔCt方法来计算基因在组织中的相对表达量，实验数据用SPSS 20.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析来分析miR-let-7在金华和长白猪的不同组织间的表达差异性，采用LSD进行多重比较。采用t检验法分析miR-let-7在品种间的肝和小肠组织中的表达差异性。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。结果数据用平均值±标准误表示。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 miR-let-7基因荧光定量扩增结果 从图1可以看出，扩增曲线为平滑的S型曲线，基线平整，拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性好。由图2可知，熔解曲线均为单峰，且重合性好，说明扩增产物单一，引物特异性强，可以用于进一步分析。说明本实验中荧光定量PCR反应特异性和重复性良好，表达定量检测结果可靠。

图1 荧光定量PCR扩增曲线

2.2 miR-let-7基因成员在不同组织中表达量的比较 相对实时荧光定量PCR检测miR-let-7家族6个成员（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在金华猪和长白猪6个组织的表达量，利用SPSS20. 0软件进行单因素方差分析并采用LSD法进行多重比较。由图3可知，在长白猪中，let-7a和let-7c在肝组织的表达量显著高于其他组织（P ＜0.05），7d-3p基因在肝组织的表达量极显著高于其他组织（P ＜0.01），let-7e和let-7g基因在肝、肾组织的表达量显著高于其他组织（P＜0.05），let-7f基因在肝、心脏中的表达量显著高于其他组织（P ＜0.05）；在金华猪中，let-7a和let-7e基因在心脏中的表达量极显著高于其他组织（P ＜0.01），let-7c基因在心脏、小肠组织中的表达量显著高于其他组织（P ＜0.05），let-7d-3p和let-7g基因在小肠和心脏中的表达量极显著高于其他组织（P ＜0.01），let-7f基因在心脏的表达量显著高于其他组织（P ＜0.05）。let-7基因家族成员在长白猪的肝组织中表达最高，在金华猪的小肠中表达最高、心脏次之。

2.3 miR-let-7基因在小肠中的表达差异分析 如图4所示，let-7基因在金华猪和长白猪小肠中的表达模式不同。在金华猪小肠组织中，let-7a和let-7c基因表达量最高，极显著高于其他成员（P＜0.01），let-7g表达量较高，let-7d-3p、let-7e和let-7f在小肠中都是低表达，且三者间无差异。在长白猪的小肠中，let-7a基因表达最高，极显著高于其他成员（P ＜0.01）；let-7c、let-7e和let-7f的表达量较高，且三者间无差异，let-7d-3p、let-7f表达量最低，两者间无差异。let-7基因成员在小肠中的表达也存在品种间的差异，在金华猪小肠中，let-7a和let-7d-3p基因表达量极显著高于长白猪（P ＜0.01），let-7c基因表达量显著高于长白猪（P＜0.05），而let-7e基因却显著低于长白猪（P ＜0.05）。

图3miR-let-7基因在金华和长白猪各组织中的相对表达量

图4miR-let-7基因在金华和长白猪小肠组织中的相对表达量

3 讨 论

与其他miRNA一样，miR-let-7基因的表达具有组织特异性[10]，在猪的肝脏、心脏和胸腺组织上有120个miRNA被鉴定出来，其中miR-499和miR-208在心脏中特异性表达，miR-122则是在肝脏特异性表达[11]。本研究结果显示，let-7基因家族6个成员（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在金华猪和长白猪心脏、肝、脾、肺、肾、小肠中均有表达，这与前人研究的let-7基因参与了心脏[12]、骨骼和肌肉[13]等器官的发育调控的结果相一致。但每个基因成员在各组织的表达量存在差异，let-7基因家族成员在长白猪的肝组织中表达量高于其他组织，在金华猪的小肠中表达量最高，心脏次之。赵俊生等[14]研究也发现，大约克夏猪的let-7i基因在小肠组织中的表达量显著高于其他组织。let-7基因家族成员在金华猪和长白猪小肠组织中表达模式不同，说明let-7基因通过基因表达量的变化实现对组织的调控作用。虽然let-7a基因在金华猪和长白猪的小肠组织中表达量都极显著高于其他组织，但金华猪let-7a基因表达量极显著高于长白猪；赵俊生等也发现miR-let-7i基因在金华猪和大约克夏猪的心脏、肝、脾、肺、肾、胰和皮脂中都有表达，但表达量存在品种间差异[14]。王云霞等[15]研究发现，随着let-7a的表达上调，细胞凋亡率增大；也有前人发现，let-7基因家族能直接或间接地作用于相关的细胞周期基因，在调控细胞分裂和分化方面发挥重要的作用[16-17]。小肠中miR-let-7基因的表达对小肠的生长抑制和潘氏细胞的增殖有关键作用[18]。let-7a在细胞生长增殖方面有重要的调控作用。苗志国等[19-21]检测发现，与长白猪相比，金华猪具有较低的始重、终重和平均日增重，有较高的胴体脂肪率、平均背膘厚、肌内脂肪；回肠黏膜绒毛高度在80 d和125 d时都显著低于长白猪，隐窝深度显著高于长白猪。猪对营养物质，尤其是脂肪的消化和吸收主要在小肠，所以金华猪和长白猪小肠的结构差异影响着两猪种的生长和脂肪形成方面的差异。推测由于let-7a基因的表达影响了小肠细胞的生长增殖，进而影响小肠对营养物质的消化吸收，let-7a基因在金华和长白猪小肠中的表达差异一定程度地影响了两猪种在生长发育和脂肪沉积方面的差异。此后，笔者的研究将预测和筛选miR-let-7可能的靶基因，以了解miR-let-7对小肠影响的分子机制和功能，为进一步探究miRNA的调控网络奠定基础，并检测miR-let-7前体基因多态性，分析其多态性与肉质或生长性状的关联，以期成为猪的肉质及生长标记。

[1] Ambros V. MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing[J]. Cell, 2003, 113(6): 673-676.

[2] Townley-Tilson W H, Callis T E, Wang D. MicroRNAs 1, 133, and 206; Critical factors of skeletal and cardiac muscle development, function and disease[J]. Int J Biochem Cell B, 2010, 42(8): 1252-1255.

[3] Parra P, Serra F, Palou A. Expression of adipose microRNAs is sensitive to dietary conjugated linoleic acid treatment in mice[J]. PLoS One, 2010, 5(9): e13005.

[4] Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J]. Cell, 2007, 129(7): 1401-1414.

[5] Zhao Y, Samal E, Srivastava D. Serum response factor regulates a muscle- specific microRNA that targets hands during cardiogenesis[J]. Nature, 2005, 436: 214-220.

[6 ] Reinhart B J, Slack F A, Basson M, et al. The 21 nucleotide let-7 RNA regulates C. elegans developmental timing in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 2000, 403(6772): 901-906.

[7] Li G, Li Y, Li X, et al. MicroRNA identity and abundancein developing swine adipose tissue as determinedby Solexa sequencing[J]. J Cell Biochem, 2011, 112(5): 1318-1328.

[8] Crippa S, Cassano M, Sampaolesi M. Role of miRNAsin muscle stem cell biology: Proliferation, differentiationand death[J]. Curr Pharm Design, 2012, 18(13): 1718-1729.

[9] Hou W, Tian Q, Steuerwald N M, et al. The let-7 microRNAenhances hemeoxygenase- 1 by suppressingBach1 and attenuates oxidant injury in human hepatocytes[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1819(11-12):1113-1122.

[10] Johnson C D, Esquela-Kerscher A, Stefani G, et al. The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J]. Cancer Res, 2007, 67(16): 7713-7722.

[11] Reddy A M, Zheng Y, Jagadeeswaran G, et al. Cloning, characterization and expression analysis of porcine microRNAs[J]. BMC Genomics, 2009, 10(1): 1.

[12] Thum T, Galuppo P, Wolf C, et al. MicroRNAs in the human heart: a clue to fetal gene reprogramming in heart failure [J]. Circulation, 2007, 116(3): 258-267.

[13] Harfe B D, Mcmanus M T, Mansfield J H, et al. The RNaseIII enzyme Dicer is required for morphogenesis but not patterning of the vertebrate limb[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(31): 10898-10903.

[14] 赵俊生, 李艳华, 周辉云, 等. 猪miR-let-7i的组织表达谱分析[J]. 中国畜牧杂志, 2015, 51(13): 6-10.

[15] 王云霞, 王琪, 周辉云, 等. miR-let-7a在大白猪甲状腺中的表达及其对甲状腺细胞凋亡的影响[J]. 农业生物技术学报, 2015, (2): 220-226.

[16] Johnson C D, Esquela-Kerscher A, Stefani G, et al. The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J]. Cancer Res, 2007. 67(16): 7713-7722.

[17] Ivey KN, Muth A, Arnold J, et al. MicroRNA regulationof cell lineages in mouse and human embryonicstem cells[J]. Cell Stem Cell, 2008, 2(3): 219-229.

[18] Madison B B, Liu Q, Zhong X, et al. LIN28B promotes growth and tumorigenesis of the intestinal epithelium via Let -7[J]. Genes Dev, 2013, 27(20): 2233-2245.

[19] 苗志国, 刘长忠, 李国旺, 等. 金华猪与长白猪生产性能和肉品质的发育差异[J]. 湖北农业科学, 2010, 49(8): 1912-1914.

[20] 苗志国. 金华猪与长白猪脂肪代谢和消化功能发育差异的研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2009.

[21] 苗志国, 刘长忠, 张金洲, 等. 金华猪与长白猪小肠黏膜形态结构发育差异的研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010, (23): 73-75.

Analysis of miR-let-7 Tissue Expression Pattern in Jinhua and Landrace Pigs

GAO Hui-zhen, CHEN Li-xing, DONG Ding-juan, GAO Tian-tian, HUANG Min-jie, XU Ning-ying*
(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Zhejiang Hangzhou 310058, China)

miR-let-7 gene family is a tissue-specific expressed and widely involved in the regulation and the development of animal tissues and organs. In our study, three of each Jinhua and Landrace pigs at 70 days old were selected to detected the expression of let-7 gene family (let-7a, let-7c, let-7d-3p, let- 7e, let-7f, let-7g) in six tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine). The differential expression of let-7 genes were analyzed in various tissues and especially in the small intestine for the Jinhua and Landrace pigs. The results showed that the expression level of let-7 genes were abundantly expressed in liver of landrace (P ＜0.05) while the expression of let-7 genes in the heart and small intestine of Jinhua pig were greater than other tissues(P ＜0.05). In the small intestine of Jinhua pig, the expression levels of let-7a and let-7c genes were significantly higher than other members of the let-7 gene family; the expression level of let-7a gene was observably higher than other members in Landrace. The expression levels of let-7a and let-7d-3p gene in small intestine of Jinhua was significantly higher than those of Landrace (P＜0.01). The expression of let-7c gene was higher than that of Landrace (P ＜0.05). But the expression of let-7e gene was lower than that of Landrace (P ＜0.05). The expression of miR-let-7 gene family was studied in this paper, it provides useful clues for further study of molecular mechanism of miR-let-7 on the growth and fat formation for Jinhua and Landrace.

miR-let-7; Gene expression ; Tissue expression ; Small intestinal ; Pig

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-044

2016-10-26；

2016-11-18

国家自然科学基金（31272424）

高慧珍（1991-），女，河南人，硕士研究生，主要从事microRNA方面研究，E-mail：21517004@zju.edu.cn

* 通讯作者：徐宁迎，E-mail：nyxu@zju.edu.cn