人参多糖对NK92-MI细胞杀伤活性的影响及机制

王欢 侯殿东 陈文娜 郭胜楠 雷萍 韩晓伟 徐铭 关洪全

1.辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 116600；2.辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁 沈阳 116600



人参多糖对NK92-MI细胞杀伤活性的影响及机制

王欢1侯殿东1陈文娜2郭胜楠2雷萍1韩晓伟1徐铭1关洪全1*

1.辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 116600；2.辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁 沈阳 116600

目的：研究人参多糖对NK92-MI杀伤活性的影响及机制。方法：采用200mg/L或400mg/L GPS作用于NK92-MI细胞，24h后收集细胞，采用CCK-8 试剂盒检测GPS对NK92-MI细胞杀伤活性和增殖活性的影响；采用流式细胞术检测GPS对NK92-MI细胞活化受体(NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D)表达的影响；采用western blot技术检测NK细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)表达水平。结果：与正常对照组相比，GPS可明显促进NK细胞杀伤活性，上调活化受体(NKp30、NKp44、NKp46)、杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达水平(P<0.05)。结论：GPS通过上调活化受体(NKp30、NKp44、NKp46)的表达促进NK92-MI细胞的活化，并且通过上调杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达提高NK92-MI细胞的杀伤活性。

人参多糖；NK92-MI细胞；杀伤活性

人参多糖(Ginseng Polysaccharides，GPS)是中药人参的主要活性成分之一，是一种高分子葡聚糖，主要由人参淀粉和人参果胶两部分组成[1]。研究发现GPS具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、造血调控、抗疲劳和抗抑郁等作用，其中免疫调节活性尤为受重视[2]。前期的研究结果表明，GPS可明显提高免疫抑制小鼠NK细胞的杀伤活性[3]。其机制可能为，GPS可能通过调节机体整体免疫功能(比如调节细胞因子的水平)而促进NK细胞的杀伤功能；或GPS进入机体也可能直接对NK细胞发挥免疫调节作用。为进一步探讨GPS对NK细胞的直接活化效应及机制，采用GPS作用于NK92-MI细胞株，揭示GPS对NK细胞作用的分子机制，为进一步研究GPS的免疫调节活性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 NK92-MI细胞株购自中科院上海细胞库。人参多糖注射液(3mg/mL)(批号：Z20025235，沈阳双鼎制药公司);CD134(NKG2D)-FITC、CD337(NKp30)-PE、CD336(NKp44)-PerCP、CD335(NKp46)-APC购自美国eBioscience公司。anti-perforin、anti-granzyme B购自美国Santa Cruz公司;α-MEM 培养基(美国Invitrogen 公司)。马血清及胎牛血清(美国HYCLONE公司);

1.2 方法

1.2.1 NK92-MI细胞培养 用含12.5% 胎牛血清和12.5%马血清的α-MEM培养基传代培养。

1.2.2 实验分组及细胞处理 实验组NK92-MI细胞分别以200mg/L或400mg/L GPS刺激，对照组加入等量PBS，24h后收集细胞。

1.2.3 NK92-MI细胞对K562 杀伤活性的测定 K562 细胞以10% FBS RPMI-1640 培养液常规传代培养。以对数期的K562细胞为靶细胞，各实验孔加入靶细胞100μL/孔(浓度为1×105/mL)，使效靶比分别为4∶1，同时设效应细胞对照孔、靶细胞对照孔及空白对照孔，各孔均设3个复孔。效靶细胞共同孵育4h后，每孔加入CCK-8 液(5mg/mL)20μL，再继续孵育1h。用酶标仪于450nm 处测定OD值。按下列公式计算NK-92MI 细胞对K562细胞的杀伤率: NK 细胞杀伤率(%)=[1-(杀伤实验组OD 值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100% 。

1.2.4 流式检测 调细胞浓度为4×105/mL，用人IgG(1μg/105)封闭Fc受体(室温，15min)。加入10μL荧光标记单抗(CD134(NKG2D)-FITC、CD337(NKp30)-PE、CD336(NKp44)-PerCP、CD335(NKp46)-APC)，4℃避光孵育30～45min。染色后的细胞用相同PBS缓冲液洗涤3次。细胞重悬于500μL含0.5%BSA的 PBS缓冲液中，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 GPS对NK92-MI细胞杀伤活性的影响 如表1所示，与正常对照组细胞相比，400mg/L GPS可明显提高NK92-MI细胞杀伤活性(P<0.05)。

表1 GPS对NK92-MI细胞杀伤活性的影响

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.2 GPS对NK92-MI细胞活化受体表达的影响 如表2及图1所示，200mg/L和400mg/L的GPS均可明显或显著上调NKp30或NKp44的表达(P<0.05或P<0.005)，400mg/L的GPS均可明显上调NKp46的表达(P<0.005)。但两个浓度的GPS对NKG2D的表达均无明显影响(P>0.05)。

表2 GPS对NK92-MI细胞活化受体表达的影响 (%)

注：与对照组相比，ΔP<0.005，*P<0.05

2.3 GPS对NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B表达的影响 如图2所示，400mg/L的GPS可有效上调NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B的表达(P<0.005),但200mg/L的GPS对穿孔素和颗粒酶B的表达均无明显影响(P>0.05)。

3 讨论

NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，是机体抵御肿瘤和病毒感染的第1道防线。NK细胞在机体抗肿瘤、抗感染、免疫调节等方面发挥着重要的作用[4]。研究表明GPS增强NK细胞的活性，提高机体抗肿瘤的能力，但相关机制研究较少。NK92-MI是源自NK-92的IL-2非依赖的NK细胞株，实验采用NK92-MI细胞株研究了GPS对NK细胞的直接活化作用。NK细胞识别和杀伤靶细胞的机制与其表面受体的特性密切相关。目前发现的NK细胞表面的活化性受体包括自然细胞毒受体(Natural Cytotoxicity Receptors，NCRs)、NKG2D、活化杀伤免疫球蛋白样受体(Killer immunogloblin-Like receptors，KIRs)及其他辅助刺活化性受体等[5-6]。活化性受体与配体交联结合后产生的激活信号导致NK细胞脱颗粒，释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶，诱导靶细胞凋亡[7]。NCRs为近年发现的一类非MHC限制的特异性启动NK细胞活化的表面分子，属于免疫球蛋白超家族受体，成员包括NKp46、NKp44和NKp30。NK细胞表面的活化性受体在细胞表面的表达程度与NK细胞功能的发挥密切相关[8]。

实验中，与正常对照组相比，400mg/L的GPS均可明显提高NK92-MI细胞杀伤活性，200mg/L和400mg/L的GPS均可明显或显著上调NKp30或NKp44的表达，400mg/L的GPS均可显著上调NKp46的表达。并且400mg/L的GPS可显著上调NK92-MI细胞穿孔素和颗粒酶B的表达。

综上所述，研究表明GPS能提高NK92-MI细胞的杀伤活性，其机制为GPS通过上调活化受体(NKp30、NKp44、NKp46)的表达促进NK92-MI细胞的活化，并且通过上调杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达提高NK92-MI细胞的杀伤活性。

[1]Cheng H,Li S,Fan Y, et al.Comparative studies of the antiproliferative effects ofginsengpolysaccharideson HT-29 human colon cancer cells[J]. Med Oncol, 2011, 28(1):175-181.

[2]Hyun-Ji Kim，Mi Hyoung Kim，Yun-Young Byon，et al．Radioprotective effects of an acidic polysaccharide of Panax ginseng on bone marrow cells[J]. J Vet Sci，2007，8( 1) : 39-46.

[3]Yaoyao Sun, Mofei Guo, Yuanjie Feng, et al. Effect of ginseng polysaccharides on NK cell cytotoxicity in immunosuppressed mice[J]. Experimentaland TherapeuticMedicine. 2016,12(6): 3773-3777.

[4]Diandong H, Feng G, Zaifu L, et al.Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) oil protects against chronic stress-induced inhibitory function of natural killer cells in rats[J].Int J Immunopathol Pharmacol, 2016, 29(1):76-83.

[5]Sandoval-Borrego D, Moreno-Lafont MC, Vazquez-Sanchez EA, et al.Overexpression of CD158 and NKG2A Inhibitory Receptors and Underexpression ofNKG2Dand NKp46 Activating Receptors onNKCells in Acute Myeloid Leukemia[J].Arch Med Res, 2016，47(1):55-64.

[6] Chang CJ, Chen YY, Lu CC, et al.Ganoderma lucidum stimulatesNKcell cytotoxicity by inducingNKG2D/NCR activation and secretion of perforin and granulysin[J].Innate Immun, 2014，20(3):301-311.

[7] Li A, He M, Wang H, et al.All-trans retinoic acid negatively regulates cytotoxic activities of nature killer cell line 92[J].Biochem Biophys Res Commun, 2007, 352(1):42-47.

[8] Chang CJ, Chen YY, Lu CC, et al.Ganoderma lucidum stimulatesNKcellcytotoxicityby inducingNKG2D/NCR activation and secretion of perforin and granulysin[J].Innate Immun, 2014，20(3):301-311.

Effects of ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells

WANG Huan1HOU Diandong1CHEN Wenna2GUO Shengnan2LEI Ping1HAN Xiaowei1XU Ming1GUAN Hongquan1*

1.Basic Medical College, Liaonign University of China Medical University，Shenyang 116600，China；2. Experiment and Technology Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 116600，China

Objective To research the influence and mechanism of Ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells.Methods CCK8 kit was adopted to detect the cytotoxicity of NK92-MI cells, Flow cytometric analysis was adopted to detect the expression of activated receptors, western blot was adopted to detect the expression level of perforin and Granzyme B.Results Compare to the normal control group, GPS could increase the cytotoxicity, expression of NKp30, NKp44, NKp46, perforin and granzymeB.Conclusion GPS can increase the cytotoxicity of NK92-MI cells by increasing expression of activated receptors, perforin and granzyme B.

GPS; NK92-MI Cells; Cytotoxicity

国家自然科学基金(81303079)；辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划(LJQ2015072)。

王欢(1988-)，女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为中药及有效成分免疫调节作用。E-mail:huan.4653@qq.com

关洪全(1954-),男，满族，教授，博士生导师，研究方向为中药及有效成分免疫调节作用。E-mail:hongquanguan@sina.com

R284.2

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1007-8517(2017)09-0037-04

2017-03-08 编辑：梁志庆)