HPLC—CAD法测定女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量

燕霞++何颂华++谢培德

【摘要】目的：建立高效液相-电雾式检测器（HPLC-CAD）方法测定女贞子药材中齐墩果酸和熊果酸的含量。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为AcclaimTM 120 C18；流动相为乙腈-50mmol/L醋酸铵（70：30）；流速为10mL /min；柱温为35℃；电雾式检测器，雾化温度35℃，采集频率10Hz。结果：齐墩果酸和熊果酸的检测质量浓度线性范围为03210～6420、01009～2018μg；精密度、稳定性、重复性试验的RSD<2%；加样回收率分别为10021%～10474%、9626%～10338%，RSD分别为178%、255%（n=6）。结论：该方法操作简便、稳定、重复性好，可用于女贞子中齐墩果酸和熊果酸含量的测定。

【关键词】 女贞子；齐墩果酸；熊果酸；HPLC-CAD；含量测定

【中图分类号】R2842【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）10-0012-03

Content Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits

of Ligustrum lucidum Aitby HPLC-CAD

YAN XiaHE SonghuaXIE Peide

Guangxi Institute for Food ang Drug Control，Nanning 530021，China

Abstract：Objective To establish an HPLC-CAD method for the determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait Methods HPLC was performed on the column of AcclaimTM 120C18 with mobile phase of acetonitrile-50mmol/L Ammonium acetate solution（70：30），at flow rate of 1mL/min，the column temperature was 35℃； CAD：nebulization temperature was 35℃ and collection frequency was 10HzResults The linear range was 0321 0-6420μg（r=0999 7）for Oleanolic Acid and 0100 9-2018μg（r=09999）for Ursolic Acid；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 20%；recoveries were 10021%～10474%（RSD=178%，n=6）and 9626%～10338%（RSD=255%，n=6），respectivelyConclusion The method is simple，stable and reproducible，and can be used for the content determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait

Keywords：Ligustri Lucidi Fructus；Oleanolic Acid；Ursolic Acid；HPLC-CAD；Content Determination

女貞子系木犀科（Oleaceae）植物女贞（Ligustrum lucidum Ait）的果实，具有补肾滋阴、养肝明目的功效，临床用于肝肾不足、头晕耳鸣、头发早白及两目昏糊等病症。研究表明女贞子中主要含有三萜类、环烯醚萜类、苯乙醇类、黄酮类、多糖类等化合物，具有抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、保肝、抗血栓形成、抗衰老及抗疲劳的作用[1]，能调节免疫，提高肿瘤患者的免疫功能[2]，是目前抗衰老、抗肿瘤方剂中的主要药物之一，其中三萜类化合物齐墩果酸与熊果酸是具有抗变异活性的主要成分。2015版《中国药典》一部收载了女贞子以特女贞苷做为含量测定指标，并未对齐墩果酸和熊果酸进行定量控制。经查阅文献[3-5]，研究者多用TLC和HPLC- ELSD法对齐墩果酸和熊果酸进行定量测定。本文采用HPLC-CAD方法同时测定女贞子药材中齐墩果酸和熊果酸的含量，建立了一种准确、快速、高效的含量测定方法，对女贞子药材及女贞子制剂的质量标准的制定具有参考价值，对其类似化合物的测定提供了参考依据。

1仪器与材料

11仪器Dionex Ultimate 3000 系统（美国赛默飞世尔科技公司）；DGP-3600RS双三元液相色谱泵；WPS-3000自动进样器；TCC-3x00（RS）柱温箱；Corona Veo RS 检测器 Chromeleon Chromatography Data System 72 SR4 色谱软件；Sartorius BP211D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-600VDB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DFT-100型中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；Milli-Q型超纯水制备仪（美国Millipore公司）。

12材料齐墩果酸（批号：110709-200304）、熊果酸（批号：110742-200516）对照品中国食品药品检定研究院；女贞子（批号：160203，广西桂林三金药业有限公司；批号：16071201，广西康全药业；批号：151001，广西一心药业；批号：20150901，广西南宁朝阳大药房）经广西食品药品检验所中药室谢培德主任鉴定均为木犀科植物女贞子Ligustrum lucidum Ait 的干燥成熟果实；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

21色谱条件与系统适用性试验色谱柱：AcclaimTM 120C18柱（46mm×250mm， 5μm） ；流动相：乙腈-50mmol/L醋酸铵（70∶[KG-*3/5]30）；流速：10mL /min；检测器为电喷雾检测器，雾化温度为35℃；载气：N2，压力635psi；柱温：35℃。进样量：混合对照品：5、15μL，供试品：10μL。在此条件下，齐墩果酸与熊果酸峰完全达到基线分离（R>15），理论板数以齐墩果酸峰计在10000以上。色谱见图1。

22溶液的制备

221混合对照品溶液精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品适量，分别置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得齐墩果酸和熊果酸对照品贮备液。分别精密量取上述贮备液适量，置于同一10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含齐墩果酸03210mg，熊果酸01009mg的溶液，即得。

222供试品溶液取样品粉末（过40目筛）10g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定质量，超声（功率：320W，频率：40KHz）处理30min，取出放冷后再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用045μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[6]。

23线性关系考察分别精密吸取“221”项下的混合对照品溶液1、5、7、10、15、20μL进样，测定峰面积。以进样量对数（X）为横坐标，对照品峰面积对数值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果得齐墩果酸回归方程为：Y=08898X+08262（r=09997）、熊果酸回归方程为：Y=08194X+08884（r=09999）。结果表明齐墩果酸在进样量为03210～6420μg时，进样量与齐墩果酸峰面积的线性关系良好；熊果酸在进样量为01009～2018μg时，进样量与熊果酸峰面积的线性关系良好。

24精密度试验取同一供试品溶液（批号：160203）适量，按“21”项下色谱条件，精密吸取10μL，连续进样6次，记录峰面积。结果齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为031%、078%（n=6），表明仪器精密度良好。

25稳定性试验取样品（批号：160203）粉末适量，按“222”项下方法制备供试品供试品溶液，分别于放置0、2、6、8、10、14、20、24h时按“21”项下色谱条件进样10μL，记录峰面积。结果，齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为105%、125%（n=8），表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

26重复性试验取样品（批号：160203）粉末适量，按“222”项下方法平行制备6 份供试品溶液，再按“21”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果齐墩果酸含量平均值为8046mg/g，RSD 为191%（n=6），熊果酸含量平均值为3288mg/g，RSD为154%（n=6），表明本方法重复性良好。

27加样回收率测定

271混合对照品贮备液的制备精密称取齐墩果酸对照品4065mg，熊果酸对照品1571mg，置250mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得混合对照品贮备液。

272回收率的测定取已知含量的样品（批号：160203）粉末适量，平行称取6份，每份05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品贮备液25mL，按“222”项下方法制备供试品溶液，再按“21”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算齐墩果酸和熊果酸的加样回收率。结果见表1。

28样品测定取4批样品各适量，分别按“222”项下方法制备供试品溶液，再按“21”项下色谱条件进样测定并计算齐墩果酸和熊果酸含量。结果见表2。

3讨论

电喷雾式检测器（CAD）作为一款质量敏感型检测器，其响应值只与进样质量有关，不依赖于化合物的结构与性质，可检测所有非挥发性化合物和部分半挥发性化合物。检测范围宽，灵敏度高，重现性好，是紫外和质谱检测器的有力补充。

实验还比较了乙腈-水、乙腈-01%甲酸、乙腈-50mmol/L醋酸铵不同的洗脱系统，结果乙腈-50mmol/L醋酸铵系统基线噪音最大，为乙腈-01%甲酸系统的3倍，乙腈-水系统的15倍，但乙腈-01%甲酸、乙腈-水系统齐墩果酸与熊果酸峰分离不好，故选用乙腈-50mmol/L醋酸铵系统。

综上所述，本研究建立了以 HPLC-CAD法同时测定女贞子中齐墩果酸与熊果酸的检测方法， 结果表明该方法简单易行，定量准确，可用于女贞子中齐墩果酸与熊果酸的定量分析，同时也为含女贞子药材的制剂的质量研究提供了参考方法。

参考文献

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[3]李芳美，祝晨蔯.女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量测定[J].今日药学，2009，19（4）：37.

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[5]盧桂英，孙贺略，杨雪滢，等.正交试验优化HPLC测定齐墩果酸与熊果酸的色谱条件[J].云南民族大学学报，2012，21（ 4）：239-242.

[6]石心红，郭江宁，翟静华. HPLC法测定女贞子中齐墩果酸、熊果酸的含量[J].海峡药学，2005，17（4）：41-43.

（收稿日期：2017-03-21编辑：陶希睿）