响应面法优化纤维素酶提取柚叶多酚工艺及其抗氧化研究

陈建福

（漳州职业技术学院 食品与生物工程系，福建 漳州 363000）

响应面法优化纤维素酶提取柚叶多酚工艺及其抗氧化研究

陈建福

（漳州职业技术学院 食品与生物工程系，福建 漳州 363000）

采用纤维素酶辅助对柚叶中的多酚进行提取，在单因素实验基础上，通过响应面法对影响柚叶多酚提取的工艺条件进行优化，建立了酶解时间、酶用量、pH、酶解温度四因子与多酚提取率的二次多项式模型，并考察了其抗氧化性能。结果表明，纤维酶辅助提取柚叶多酚的最佳工艺条件为：酶解时间80 min，酶用量200 U、pH5.8、酶解温度49℃。在此条件下柚叶多酚的提取率为35.90 mg·g-1，与预测值相比，其相对误差为0.582%，验证了回归方程的有效性，说明响应面模型可以较好地预测柚叶多酚的提取率，该工艺与无酶预处理的超声辅助提取工艺相比，提取率提高了23.20%，柚叶多酚对羟自由基有一定的清除能力，并能与维生素C起协同作用。

柚叶；多酚；纤维素酶；响应面，抗氧化

柚子，又名文旦、内紫等，是芸香科植物柚的成熟水果，在我国福建、广东、广西、湖南等14个省区均有分布[1-2]。柚子营养丰富，具有丰富的有机酸、蛋白质及其他一些人体所需要的微量元素，越来越受到了人们的欢迎[3-4]。漳州是琯溪蜜柚的主产地，随着蜜柚产量的增加，每年由于蜜柚摘取后剩下的柚叶也在逐年增加，柚叶中含有大量的多酚类等天然有效成分，因此常具有抗衰老、抗炎、抗菌、净化空气等功效[5-6]，被用来制作成沐浴露、塔香、洗发水、洗手液、隔离防护霜，然而由于加工技术的落后，在果农摘完琯溪蜜柚后，没有对柚叶深加工，造成了极大的浪费。

本实验在超声波辅助提取柚叶多酚的基础上，用纤维素酶对柚叶进行预处理，使纤维素酶分解柚叶细胞壁上的纤维素，促进细胞内部的多酚类物质更大容量地溶出，考察纤维素酶预处理对柚叶多酚提取率的影响；并通过响应面法对影响柚叶多酚纤维素酶预处理的工艺流程进行优化，研究其对羟基自由基的清除作用，为柚叶多酚的综合利用提供理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

数显鼓风干燥箱GZX-9070MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；冷冻干燥机LGJ10-C，北京四环科学仪器厂；电子天平BSA124S，赛多利斯科学仪器有限公司；超声波清洗机SCQ-3201E，上海声彦超声波有限公司；紫外可见分光光度计UV-1800PC-DS2，上海美谱达仪器有限公司；高速多功能粉碎机Q-250B，上海冰都电器有限公司。

柚叶，采于漳州市平和县的琯溪蜜柚；纤维素酶（10000 U·g-1），食品级，天津市诺奥科技发展有限公司；食用酒精（乙醇），食品医药级，河南浩宇食品添加剂有限公司；硫酸锂，分析纯，西陇化工股份有限公司；钨酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；没食子酸，分析纯，天津市瑞金物化学品有限公司，钼酸钠，分析纯，天津市化学试剂四厂；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 多酚含量的测定

采用福林-酚法[7]，配制0.1 mg·mL-1的没食子酸标准溶液，分别准确移取一定浓度梯度（0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2 mL）的没食子酸标准溶液加入到10 mL容量瓶中，再分别加入6 mL的蒸馏水与0.5 mL的福林-酚试剂，摇匀，1 min后再分别加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，定容，并置于75℃水浴中10 min，冷却，于765 nm处测定吸光度，绘制曲线，并进行回归，得回归方程。用上述方法进行测定并代入回归方程计算得到

其中：b为柚叶多酚质量浓度/mg·mL-1；V为提取液定容后的体积/mL；m为柚叶质量/g。

1.2.2 超声波辅助提取方法

将采摘的柚叶用清水浸泡洗净，再用蒸馏水淋洗，晾干，并用冷冻干燥机进行干燥，粉碎，过筛备用。提取时，称取一定量的柚叶粉末，装入100 mL烧瓶中，置于超声波清洗器中，在设定的操作条件下进行提取，提取结束后，过滤去渣，稀释，定容，按1.2.1中的方法计算柚叶多酚的提取率。通过响应面方法对超声波辅助提取柚叶多酚的工艺进行了优化，得到了最佳工艺条件为：超声温度63℃、超声功率245 W、液料比25 mL·g-1、超声时间28min、乙醇浓度60%，柚叶多酚提取率为29.14 mg·g-1，并以此超声辅助提取柚叶多酚的最佳工艺条件作为柚叶酶处理后的提取工艺。

1.2.3 纤维素辅助提取柚叶多酚

利用纤维素酶对柚叶进行预处理，预处理完后，在最佳的超声工艺条件下，对柚叶多酚进行提取，并计算得到柚叶多酚的提取率，酶解工艺如下：

1.2.3.1 酶解时间对多酚提取率的影响

固定酶用量200 U、pH5.5、酶解温度50℃的条件下，考察不同酶解时间（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min）对柚叶多酚提取率的影响。

1.2.3.2 酶用量对多酚提取率的影响

在固定酶解时间80 min、pH 5.5、酶解温度50℃的条件下，考察不同酶用量（50 U、100 U、150 U、200 U、250 U、300 U）对多酚提取率的影响。

1.2.3.3 pH对多酚提取率的影响

固定酶解时间80 min、酶用量200 U、酶解温度50℃的条件下，考察不同pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 、6.5）对多酚提取率的影响。

1.2.3.4 酶解温度对多酚提取率的影响

固定酶解时间80 min、酶用量200 U、pH 5.5的条件下，考察不同酶解温度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）对多酚提取率的影响。

1.2.4 抗氧化能力研究

利用对羟自由基的清除能力来评价多酚的抗氧化能力，羟自由的清除能力按文献[8]方法所示。

1.3 响应面的因素与水平设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken实验设计原理，选取酶解时间（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解温度（D）四因素为自变量，柚叶多酚提取率为响应值，设计四因素三水平实验，因素与水平见表1。

表1 因素与水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解时间对多酚提取率的影响

从图1中可以看出，当酶解时间在20～80 min时，随着酶解时间的延长，多酚提取率不断增大，当酶解时间超过80 min时，多酚提取率又开始下降。这是因为随着酶解时间的延长，酶的作用时间长，酶活力得到充分体现，酶解反应进行越来越彻底，多酚提取率增加，而当酶解时间过长时，酶解作用效果不再明显，多酚提取率甚至开始下降[9]，因此，最佳的酶解时间选择为80 min。

图1 酶解时间对多酚提取率的影响

2.1.2 酶用量对多酚提取率的影响

图2 酶用量对多酚提取率的影响

从图2中可以看出，当酶用量的在50～200 U时，随着酶用量的增加，多酚提取率不断增大，当酶用量超过200 U时，多酚提取率又开始下降。这是因为随着酶用量的增加，纤维素酶与柚叶颗粒的作用点越来越多，增加了酶解速率，提高了多酚的溶出，当酶用量过大时，过多的酶会堆积而包裹住柚叶颗粒，阻碍多酚的传质[10]。因此，最佳的酶用量选择为200 U。

2.1.3 pH对多酚提取率的影响

从图3中可以看出，当pH在4.0～5.5时，随着pH的上升，多酚提取率不断增加，当pH超过5.5时，多酚提取率又开始下降。这是因为pH较低时，酸性太强会影响纤维素酶的构象，从而影响酶的活力，而当pH过大时，酸性较低，破坏了酶空间结构中的共价健作用，而使酶变性，导致多酚提取率下降[11]，因此，最佳的pH选择为5.5。

图3 pH对多酚提取率的影响

2.1.4 酶解温度对多酚提取率的影响

从图4中可以看出，当酶解温度在40～50℃时，随着酶解温度的升高，多酚提取率不断增加，当酶解温度超过50℃时，多酚提取率又开始下降，这是因为酶解温度较低时，酶促反应较慢，随着酶解温度的升高，酶的反应速率增加，增加了纤维素酶与柚叶颗粒细胞壁的作用频率，多酚提取率增大，而当酶解温度过高时，酶活力减弱，甚至会发生酶失活而丧失催能力，使得多酚提取率的下降[12]，因此，最佳的酶解温度选择为50℃。

图4 酶解温度对多酚提取率的影响

2.2 响应面法优化柚叶多酚提取工艺

2.2.1 响应面分析及结果

根据Box-Benhnken实验设计，以柚叶多酚提取率（Y）为响应值，酶解时间（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解温度（D）为自变量，通过，Design-Expert 8.05b软件进行响应面分析，实验结果和方差分析如表2、表3所示。

表2 响应面方案及结果

表3 方差分析

利用Design-Expert 8.05b统计软件对表2数据进行多元回归拟合，得到柚叶多酚提取率（Y）与酶解时间（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解温度（D）的二次多项回归方程：

由表3可知，该回归模型极显著（P＜0.001），失拟项不显著（P=0.1753＞0.05），相关系数R2= 0.9147，说明有超过91%的数据可用利用该模型进行分析，方程拟合较好；一次项A、B，交互项AB、AC、BC、BD、CD对柚叶多酚提取率影响不显著（P＞0.05）；一次项C、D，交互项AD，二次项A2、B2、C2、D2对柚叶多酚提取率影响极显著（P＜0.01）；根据F值及P值均可判断，各因素对柚叶多酚提取率影响作用顺序为：pH＞酶解温度＞酶用量＞酶解时间。

2.2.2 因素间的相互作用分析

图5 酶解各因素交互作用对多酚提取率的影响

图5 是纤维素酶对柚叶预处理过程的各工艺条件对柚叶多酚提取率的响应面图。图中描述的是所考察的四个工艺条件中任意两个因素为零水平时，另两个工艺条件的交互作用对柚叶多酚提取率的影响。从图5中可以看出，酶解时间和酶解温度的响应面曲线较陡，说明酶用量和酶解时间的交互作用对柚叶多酚的提取率影响最为显著，酶解时间和pH的响应面曲线相对较陡，说明酶解时间和pH的交互作用对柚叶多酚的影响显著性次之，而pH和酶解温度的响应面曲线最为平缓，说明pH和酶解温度的交互作用对柚叶多酚的影响最不显著。综合以上分析可得，影响纤维素酶辅助提取柚叶多酚提取率的主次因素顺序为pH＞酶解温度＞酶用量＞酶解时间。

2.2.3 最佳提取条件的确定及验证

通过回归方程进行预测得到纤维素酶辅助提取柚叶多酚的最佳条件为：酶解时间80.03 min，酶用量201.29 U、pH 5.76、酶解温度49.38℃，在此最佳条件下，回归方程预测的最大柚叶多酚提取率为36.11 mg·g-1。为实际操作的便利性，将预测的最佳工艺条件修正为：酶解时间80 min，酶用量200 U、pH 5.8、酶解温度49℃。在此最佳条件下对柚叶多酚进行提取，提取3次进行验证实验，柚叶多酚的平均提取率为35.90 mg·g-1，与预测值相比，其相对误差为0.582%，验证了回归方程的有效性，说明利用响应面法对纤维素酶辅助提取柚叶多酚的工艺进行优化是可靠的，具有一定的应用价值，且该工艺与没有进行酶预处理的超声波辅助工艺相比[13]，提取率提高了23.20%，为柚叶多酚的开发与利用提供新的依据。

2.3 柚叶多酚的抗氧化能力

羟基自由基是引发各种疾病的一种强活性自由基，以柚叶多酚对羟自由基的清除率来考察其抗氧化性能，如图6所示。从图6中可以看出，柚叶多酚和维生素C对羟基自由基均有一定的清除能力，并随着柚叶多酚和维生素C浓度的增加而增大，在相同浓度下，维生素C对羟自由基的清除率能力要强于柚叶多酚。但当柚叶多酚与维生素C混合时（质量1∶1混合），在一定浓度时，柚叶多酚会与维生素C产生协同作用，而使得其混合物具有较高的羟基自由基清除能力。

图6 柚叶多酚和维生素C对·OH的清除能力

3 结论

以柚叶为原料，采用纤维素酶对柚叶中的多酚进行辅助提取，在单因素实验的基础上，采用响应面法对影响柚叶多酚提取的工艺条件进行优化，建立了二次多项式方程，并确定了最佳工艺条件为：酶解时间80 min，酶用量200 U，pH 5.8，酶解温度49℃。在最佳工艺条件下，柚叶多酚的提取率为35.90 mg·g-1，与预测值相比，其相对误差为0.582%，验证了回归方程的有效性，说明利用响应面法对纤维素酶辅助提取柚叶多酚的工艺进行优化是可靠的，具有一定的应用价值，且该工艺与没有进行酶预处理的超声波辅助工艺相比，提取率提高了23.20%，柚叶多酚对羟基自由基有一定的清除能力，并能够与维生素C产生协同作用，为柚叶多酚抗氧剂的开发与利用提供新的依据。

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Optimization of Cellulose-assisted Extraction of Polyphenols from Pomelo Leaves Using Response Surface Methodology and its Antioxidant Activities

CHEN Jiɑnfu

（School of Food and Biological Engineering，Zhangzhou Institute of Technology，Zhangzhou Fujian 363000，China）

Polyphenols were extracted from pomelo leaves by cellulose-assisted extraction.Based on the single-factor experiment，the involving factors was optimized by using response surface analysis and a quadratic polynomial regression equation was established for the yield of polyphenols as function of enzymolysis time，enzyme amount，pH and enzymolysis temperature and antioxidant activities were examined.The results showed that the optimal extraction conditions of polyphenols from pomelo leaves were：enzymolysis time 80 min，enzyme amount 200U，pH 5.8，enzymolysis temperature 49℃.The yield of total flavonoids could be up to 35.90 mg·g-1under the optimal extraction condition，the relative error was 0.582%compared to the predictive value，which indicated the feasible model fitted well with the experimental data.Results showed that the response surface model could be used to predict the extraction yield of polyphenol from pomelo leaves.The extraction yield increased by 23.20%compared to ultrasonic assisted extraction technology with no enzyme pretreatment and it had good free radicals scavenging activity and synergy with vitamin C.

Pomelo Leaves；Polyphenols；Cellulose；Response Surface Methodology；Antioxidant Activities

Q55；S38

A

1009-8666（2017）04-0011-07

10.16069/j.cnki.51-1610/g4.2017.04.003

［责任编辑、校对：李书华］

2017-01-03

福建省高校杰出青年科研人才培育计划（闽教科[2015]54号）；福建省中青年教师教育科研项目计划“柚叶多酚的分离及性能研究”（JA15688）

陈建福（1982—），男，福建南安人。漳州职业技术学院讲师，博士，研究方向：天然产物化学工艺。