叶下珠抑制人肾癌786-0细胞增殖作用的研究※

黄桥华 郭晓静 刘小云

叶下珠抑制人肾癌786-0细胞增殖作用的研究※

黄桥华 郭晓静 刘小云

（赣南医学院第一附属医院中药房，赣州341000）

目的观察叶下珠提取物对人肾癌786-0细胞增殖抑制作用并探讨叶下珠提取物发挥该作用的机制，为叶下珠的临床应用更进一步的提供理论依据。方法用不同浓度的叶下珠（浓度分别为1、10、100、1000 μg/m L）作用于人肾癌786-0细胞株，采用CCK-8法检测叶下珠对肾癌786-0细胞增殖效应的影响，采用流式细胞术（FCM）检测叶下珠对肾癌786-0细胞周期的影响，采用蛋白印迹法检测叶下珠对Survivin蛋白表达水平的影响。结果CCK-8法结果提示，不同浓度的叶下珠均可显著抑制肾癌786-0细胞的增殖，且抑制率呈时间、剂量依赖关系。FCM检测发现叶下珠可使肾癌786-0细胞周期中的G0/G1期比例增加，S期缩短。蛋白印迹法显示，叶下珠可使肾癌786-0细胞中Survivin蛋白表达水平降低。结论通过建立人肾癌786-0细胞的体外抗肿瘤实验模型，预试验结果表明叶下珠乙醇提取物对人肾癌786-0细胞增殖具有抑制作用。

叶下珠；肾细胞癌；786-0细胞增殖；抑制作用

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）简称肾癌，约占所有恶性肿瘤的2%。肾癌是最为耐药的恶性肿瘤之一，对化疗和放疗均不敏感，目前公认手术仍是治疗的唯一有效方法，因此进一步探索更有效的肾癌治疗药物成为医药学界的研究热点之一[1]。中药或天然药物毒副作用小、具有悠久的民间应用历史，已成功开发的药物有紫杉醇、喜树碱类等，因此从中草药中开发高效、低毒的抗肿瘤药物具有重要意义。本研究主要观察叶下珠提取物对人肾癌786-0细胞增殖抑制作用并探讨叶下珠提取物发挥该作用的机制，现报告如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料用不同浓度的叶下珠（浓度分别为1、10、100、1000 μg/m L）作用于人肾癌786-0细胞株。

1.2 研究方法采用CCK-8法检测叶下珠对肾癌786-0细胞增殖效应的影响，采用流式细胞术（FCM）检测叶下珠对肾癌786-0细胞周期的影响，采用蛋白印迹法检测叶下珠对Survivin蛋白表达水平的影响。叶下珠不同溶剂萃取部位经培养基稀释成不同浓度，于不同时间点用MTT法观察不同浓度的各提取部位对肾癌786-0细胞的增殖抑制作用，筛选出具有抗肿瘤活性的有效部位提取物。

1.3 统计学处理应用SPSS23.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示，不同时间、不同浓度行重复测量方差分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的叶下珠对786-0细胞增殖的影响CCK-8法结果提示，不同浓度的叶下珠均可显著抑制肾癌786-0细胞的增殖，且抑制率呈时间、剂量依赖关系。FCM检测发现叶下珠可使肾癌786-0细胞周期中的G0/G1期比例增加，S期缩短。

表1 不同浓度的叶下珠对786-0细胞增殖的影响

2.2 叶下珠对786-0细胞周期的影响FCM检测发现叶下珠可使肾癌786-0细胞周期中的G0/G1期比例增加，S期缩短。蛋白印迹法显示，叶下珠可使肾癌786-0细胞中Survivin蛋白表达水平降低。

表2 叶下珠对786-0细胞周期的影响

3 讨论

叶下珠（Phyllamhus urinaria Linn）为大戟科植物叶下珠的带根全草，叶下珠别名为珍珠草、珠子草、叶下珍珠等十多种名称[2]。主要分布于长江以南各省区，传统功效用于肾炎水肿，泌尿系感染、结石，肠炎，痢疾，眼角膜炎，黄疸型肝炎等[3]。自从20世纪90年代，Pettit CR等在研究中发现有叶下珠分离的一些木脂素对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用后，叶下珠对肿瘤细胞的抑制作用受到各国学者的广泛关注[4]。近年来国内外报道叶下珠能够抑制肝癌细胞生长和抗乙肝病毒方面的研究较多，但至今国内外尚未见叶下珠对人肾癌的抗肿瘤活性的报道[5]。基于叶下珠用于肾炎水肿，泌尿系感染、结石等泌尿系统疾病的传统功效和天然药物毒副作用小的优点，激发我们对其治疗肾癌的思考和探讨，本项目拟以人肾癌786-0细胞作为体外抗肿瘤实验模型，采用MTT法考察叶下珠提取物对人肾癌786-0细胞的体外抗肿瘤活性，同时探讨其作用机制，为进一步扩展叶下珠化学成分、药理机理的研究以及叶下珠新产品开发和临床应用提供理论依据，在选题上具有创新性，值得深入探讨。

叶下珠味微苦、甘，性凉。归肝、肺二经[6]。具有清热平肝，解毒清肿功效。肾细胞癌（renal cell carcinoma），简称肾癌，是由肾小管上皮细胞发生的恶性肿瘤，故又称肾腺癌，是肾脏最常见的恶性肿瘤（占肾脏恶性肿瘤的85%）[7]。肾细胞癌早期症状不明显，发现时肿瘤体积已较大[8]。腰痛、肾区肿块和血尿为具有诊断意义的三个典型症状，但三者同时出现的比例很小[9]。无痛性血尿是肾癌的主要病变，血尿常为间歇性，早期可仅表现为镜下血尿[10]。肿瘤可产生异位激素和激素样物质，患者可出现多种副肿瘤综合征，如红细胞增多症、高钙血症、库欣综合征和高血压等。本组资料显示，通过建立人肾癌786-0细胞的体外抗肿瘤实验模型，预试验结果表明叶下珠乙醇提取物对人肾癌786-0细胞增殖具有抑制作用。

[1]张旖骁，吴斌.miR-497与肾癌预后的关系及其对肾癌786-0细胞增殖、凋亡和侵袭的影响[J].中国病理生理杂志，2016，32(11)：1979-1983.

[2]刘侃，赵超飞，陈建文，等.硒蛋白PP1(SEPP1)过表达抑制786-0和769-P人肾癌细胞增殖并引起G2/M期阻滞[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，14 (6)：764-769.

[3]赵建通，张磊，刘文瞻，等.姜黄素与索拉非尼联合对人肾癌细胞株786-0增殖抑制作用的体外研究[J].河北医药，2016，12(4)：495-498.

[4]袁海鑫，辛士永，肖飞，等.沉默PDCD4对786-0细胞增殖能力的影响[J].吉林医学，2016，25(2)：261-263.

[5]吴瑞环，张振凌，王瑞生，等.千金子炮制前后对人肾癌786-0细胞增殖及特异抗原G250基因表达的影响[J].中华中医药杂志，2016，18(1)：306-309.

[6]Bin Xu，Yunfeng He，Xiaohou Wu，Chunli Luo，Anquan Liu，Jun Zhang.Exploration of the Correlations Between Interferon-γ in Patient Serum and HEPACAM in Bladder Transitional Cell Carcinoma，and the Interferon-γ MechanismInhibitingBIU-87Proliferation[J].TheJournalofUrology.2012,188 (4):1346-1353.

[7]Taira，Naoe，Mimoto，Rei，Kurata，Morito，Yamaguchi，Tomoko，Kitagawa，Masanobu，Miki，Yoshio，Yoshida，Kiyotsugu.DYRK2 priming phosphorylation of c-Jun and c-Myc modulates cell cycle progression in human cancer cells[J].Journal ofClinical Investigation,2012 122(3):859-872.

[8]Huiming Lv，Huiya Zhang，Jiaolei Wu，Yongmei Guan.Effect of plasmidmediated stable interferon-γ expression on proliferation and cell death in the SKOV-3humanovariancancercellline[J].ImmunopharmacologyandImmunotoxicology.2011,33(3):498-503.

[9]Chunhua Xun，Chunli Luo，Xiaohou Wu，Qiaolin Zhang，Ling Yan，Shali Shen.Expression of hepaCAM and Its Effect on Proliferation of Tumor Cells in Renal Cell Carcinoma[J].Urology.2010,75(4):828-834.

[10]Xiao-Ling Guo，Ling Pan，Xue-Jun Zhang，Xiao-Hui Suo，Zhi-Yun Niu，Jing-Yu Zhang，Fuxu Wang，Zuo-Ren Dong，Wanming Da，Ruzo Ohno.Expression and mutation analysis of genes that encode the Myc antagonists Mad1，Mxi1 and Rox in acute leukaemia[J].Leukemia&Lymphoma.2009, 48(6):1200-1207.

Inhibitory Effect of Phyllanthus Urinaria on the Proliferation of Human Renal Carcinoma Cell Line 786-0

HUANG Qiaohua,GUO Xiaojing,LIU Xiaoyun
(Pharmacy of Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Jiangxi Province, Ganzhou 341000,China)

Objective To observe the effect of Phyllanthus extract on proliferation of human renal cell carcinoma 786-0 cells,and to investigate the mechanism of the inhibitory effect of Phyllanthus extract,and to provide theoretical basis for further clinical application.Methods Different concentrations of Phyllanthus urinaria(concentrations of 1,10,100,1000 g/m L)in human renal cell carcinoma 786-0 cell line,CCK-8 method was used to detect the effect of Phyllanthus effect on proliferation of renal cell carcinoma 786-0 cells,using flow cytometry(FCM)detection effect of Phyllanthus on renal cell carcinoma 786-0 cell cycle effect of Phyllanthus, detection on the expression of Survivin protein by Western blot.Results The results of CCK-8 showed that different concentrations of Phyllanthus significantly inhibited the proliferation of 786-0 cells,and the inhibition rate was time and dose dependent.FCM detected that Phyllanthus can make renal carcinoma 786-0 cell cycle in G0/phase G1 was increased,and S shortened.Western blot showed the level of p.urinaria,reduces the expression of Survivin protein in renal cell carcinoma 786-0 cells.Conclusion The establishment of experimental model of human renal cell carcinoma 786-0 cells in vitro anti pre test results showed that the ethanol extract of Phyllanthus has inhibitory effect on the proliferation of human renal cell carcinoma 786-0 cells.

Phyllanthus urinaria;renal cell carcinoma;786-0 cell proliferation;inhibition

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.11.064

1672-2779（2017）-11-0145-02

：杨杰本文校对：赖玉中

2017-02-26）

江西省卫生计生委科技计划项目【No.20165365】