解淀粉芽孢杆菌高密度发酵条件的优化

王涛，刘健，左建英，张俊，侯永春，龚骁，孙群

（1.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064；2.四川龙蟒福生科技有限责任公司，四川 眉山 620036）

解淀粉芽孢杆菌高密度发酵条件的优化

王涛1，2，刘健1，左建英2，张俊2，侯永春2，龚骁2，孙群1

（1.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064；2.四川龙蟒福生科技有限责任公司，四川 眉山 620036）

该文探讨解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）1841的高密度工业发酵工艺优化，为解淀粉芽孢杆菌的工业化生产提供依据。以平板菌落直径、及培养后的活菌浓度为指标，对种子的保存方法、活化方式和培养基、发酵培养基中的酵母粉和大豆蛋白粉用量以及发酵的后期调控进行筛选和优化。筛选出最佳的工业菌种保存条件为30%甘油为保护剂，-64℃保存；最佳活化方法为采用PDA培养基活化，并经过一次48h活化和24h二次活化；最佳的转菌时间为在种子培养后17～18h。最佳的酵母粉和大豆蛋白粉浓度分别为20g/L和40g/L，发酵的后期调控需要进行补料和流加氨水将pH控制在7.0±0.2，发酵时间延长至72h。通过对发酵的基本条件进行筛选和优化，得到可在100L发酵罐上进行高密度发酵的体系，发酵浓度可达常规发酵的100倍（＞1×1014CFU/mL）。

解淀粉芽孢杆菌；保存；活化；高密度发酵

0 引言

近年来，由于化学农药的过渡使用导致了严重的食品安全和环境问题，生物农药的使用已成为一种新的趋势。目前产业化应用较多的主要包括地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等[1]。其中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的一个近缘种，具有广泛的抑制真菌和细菌活性。目前已开发的解淀粉芽孢杆菌制剂主要为Subtilex，由美国Microbiol Ltd.公司开发，根部施用或拌种可防治镰刀菌、曲霉、交链孢和丝核菌引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。冯金龙[2]通过试验证明解淀粉芽孢杆菌对马铃薯枯萎病菌（Fusarium tricinctum），马铃薯丝核病菌（Rhizoctonia solani），苹果轮纹病菌[3]和马铃薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）都有良好的抑制作用，可致病原菌菌丝膨大、断裂及溶解等[4]。研究发现解淀粉芽孢杆菌是通过产生芽孢菌毒素和大环内酯类抗生素抑制土传病害[5-6]；Wang等[7]研究发现，解淀粉芽孢杆菌可以诱导烟草产生抗性；Srivastava等[8]发现解淀粉芽孢杆菌可以增加在生物胁迫下水稻的产量。除此之外，解淀粉芽孢杆菌甚至还可以应用在养殖和畜产品加工领域[9]。

目前国内关于解淀粉芽孢杆菌的工业高密度发酵研究较少，车晓曦[10]从最佳碳源、氮源、初始pH值、发酵时间、发酵温度、接菌量和装液量的确定出发，针对一株新发现的解淀粉芽孢杆菌SAB-1进行发酵培养基的设计及发酵条件的优化。该条件下发酵后菌体产量为4.6×1010CFU/mL。已报道的市场同类型解淀粉芽孢杆菌发酵单位约为1×1012CFU/mL，发酵水平相对偏低，不利于制剂开发和田间应用。本研究利用实验室前期获得的对灰霉菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌、玉米尾孢菌等多种植物病原菌的拮抗菌株B.amyloliquefaciens 1841为研究对象，通过研究菌种最佳保存和活化条件、最适接种时期，以及发酵培养基优化，发酵后期调控条件的摸索，旨在提高工业发酵的菌体浓度，达到高密度发酵。

1 实验材料

1.1 实验菌种

解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）菌株1841引进自俄罗斯，由本实验室保藏。

1.2 培养基

种子活化培养基为PDA培养基及NA培养基。

一级种子摇瓶培养基为酵母浸粉2%、糖蜜2%、玉米蛋白粉1%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.3%、氯化钠0.03%、pH自然。

发酵培养基在种子摇瓶培养基基础上添加不同量酵母粉、大豆蛋白粉。

1.3 发酵罐

100L发酵罐：容积100L，型号15R102-1，上海国强生化工程装备有限公司。

2 实验方法

2.1 种子保存

将解淀粉芽孢杆菌种子在4种不同的甘油浓度和温度组合（15%甘油+-20℃、15%甘油+-64℃、30%甘油+-20℃、30%甘油+-64℃）下保存。3个月后，将保存的种子取出进行平板活化，培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径，判断最适宜的保存方法。

2.2 种子活化

对比不同培养基（NA和PDA）、不同活化方式（活化48h、活化48 h后再转接活化24 h），培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径，用活菌计数法测定培养后的菌体浓度，以此为依据判断最佳活化培养基及活化时间。

2.3 确定种子生长曲线，判断最佳的转种时间

种子摇瓶接种后从0～24 h每2 h取0.5mL样品进行OD值测定[11]。其中，种子摇瓶使用带挡板的500mL三角瓶（装液量50mL），接种量2环，30℃，200 r/min培养24h。

2.4 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌生长的影响

1）以一级种子摇瓶培养基为基本培养基，培养基中加入酵母粉，使其含量分别为10，15，20，25g/L。摇床300 r/min、28～32℃、通气条件下培养72h，测定活菌数确定最佳酵母粉含量[12]。

2）以一级种子摇瓶培养基为基本培养基，分别在培养基中加入大豆蛋白粉，使其含量为0，10，20，40 g/L，摇床300 r/min、28～32℃、通气条件下培养72h，测定活菌数，确定最佳大豆蛋白粉含量。

2.5 发酵后期调控

以前期试验优化的培养基为基础培养基，通过优化发酵过程，确定最佳的发酵调控路线。其中，对照组基础培养基灭菌前pH调为7.0，发酵过程不补料。试验组1基础培养基灭菌前pH调为7.0，发酵过程连续流加C源（糖蜜）。试验组2基础培养基灭菌前pH调为7.0，发酵过程连续流加C源（糖蜜），用氨水控制pH 7.0。

发酵过程根据菌体生长曲线情况取样，分别测定OD值、活菌浓度，以及对主要抑菌代谢产物[13]进行过程监控。通过不同时间的取样结果确定发酵过程各指标的变化趋势。

3 结果与分析

3.1 保存条件对菌种活化的影响

对不同的甘油浓度和保存温度组合条件下的菌种进行活化培养试验，结果如图1所示，相对于15%的甘油，30%甘油能更好地保护菌种在低温下的存活，提高菌种复苏后的生长速度，菌落直径和发酵后的菌体浓度明显提高；相对-20℃的温度，-64℃温度能极大地降低细胞代谢，提高菌种活力。因而最佳的保存条件为30%甘油为保护剂，-64℃保存。

3.2 培养基及活化方式对菌种活化的影响

以图1中最优的保存条件（30%甘油，-64℃）下的菌种，在不同培养基（NA和PDA）经过不同活化时间，实验结果如图2所示。PDA培养基活化效果更好，经过一次48 h活化和24 h二次活化后，菌落直径和培养后的菌体浓度明显提高，更利于后期的发酵放大。

3.3 种子生长曲线和最佳转种时间

处于对数期的菌种进行工业发酵接种具有产品一致性好、发酵周期短、节约成本等优点，通过测定解淀粉芽孢杆菌的种子生长曲线（如图3所示），初步确定种子培养时间为17～18h。

3.4 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌生长的影响

3.4.1 酵母粉浓度筛选

通过对比试验不同浓度酵母粉，确定当酵母粉浓度达到25g/L时，发酵单位最佳，为1.8×1010CFU/mL（结果如图4所示）。但与酵母粉浓度20g/L时相比，差异不大，考虑发酵成本选择添加酵母粉浓度20g/L。

图1 不同甘油浓度、温度组合的菌落直径和活菌浓度

图2 不同培养基、活化时间组合的菌落直径、活菌浓度

图3 种子生长曲线

3.4.2 大豆蛋白粉浓度筛选

在确定酵母粉添加量为20g/L的基础上，通过添加不同浓度大豆蛋白粉，确定当大豆蛋白粉浓度达到40g/L时，发酵单位最高（如图5所示）。并且当大豆蛋白粉添加量大于40g/L时，由于发酵气泡严重，实验无法继续。因此，大豆蛋白粉的最佳添加量为40g/L。

3.4.3 发酵调控优化

图4 不同酵母粉浓度下的活菌数

图5 不同大豆蛋白粉浓度下的活菌数

在上述试验基础上，根据前期发酵摸索，确定在实验室100L发酵实验罐上设定最佳参数：接种量为0.3%，装液量为50 L，搅拌转速为300 r/min，发酵温度为（30±0.2）℃，运行罐压：0.04～0.06MPa，空气流量为1 vvm，灭菌前使用液体NaOH将培养基pH调至7.0±0.2，发酵周期为发酵72h下罐，过程取样检测。

对照组（未进行补料及pH调整）：发酵水平最低，活菌数为4.5×1012CFU/mL。

试验组1（过程补料，但未对pH调整）：活菌数为8.3×1013CFU/mL。

试验组2（过程补料，流加氨水将pH控制在7.0±0.2）：发酵单位最高，活菌数为4.0×1014CFU/mL。

通过上述发酵调控过程，结果显示在酵母粉20g/L、大豆蛋白粉40g/L，过程补料、流加氨水将pH控制在7.0±0.2，发酵水平是对照组的100倍，初步判断氨水作为调节pH的同时起到补充氮源的作用（见图6）。

图6 不同发酵控制下的活菌浓度

4 结束语

已有研究表明，低温条件和甘油保护剂有利于菌种保存，-20℃不能完全抑制细胞代谢，但-80℃和液氮低温环境不利于工业发酵过程中的周期性保存复苏，因而工业菌种保存采用-64℃更好。

培养基中各种营养成分对芽孢杆菌发酵具有重要影响，如金敏等[14]发现地衣芽孢杆菌最佳碳源为蔗糖，氮源为明胶。舒丹等[15]发现一株芽孢杆菌最佳发酵温度高达50℃。本实验菌株最佳发酵氮源为酵母粉和大豆蛋白粉。由于发酵气泡的限制，高浓度的大豆蛋白粉的效果并不好，但发现菌株的生长量与氮源的添加量成正相关。在发酵调控方面，研究表明氨水的添加可给解淀粉芽孢杆菌1841菌株最适pH，同时起到了缓慢添加氮源的作用，使其调控朝着高密度发酵的方向进行。

本研究只是在100L发酵实验罐条件下开展解淀粉芽孢杆菌1841的发酵调控进行的优化，还需在后续的中试环节验证完善、优化发酵控制，同时在培养基筛选方面还需考察无机盐、消泡剂等对发酵的影响，以获得合适的发酵工艺，在实际的发酵工业化放大、生产过程中对发酵条件、补料物质的筛选、补料方式等有待更加深入的研究。以达到降低阻遏发生，提高菌体生物量。

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（编辑：莫婕）

Optim ization of high-density fermentation for Bacillus amyloliquefaciens

WANG Tao1，2，LIU Jian1，ZUO Jianying2，ZHANG Jun2，HOU Yongchun2，GONG Xiao2，SUN Qun1
（1.College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Sichuan Lomon Bio Technology Co.，Ltd.，Meishan 620036，China）

This study explored the high-density fermentation conditions of Bacillus amyloliquefaciens 1841 by using colony diameter and culturing concentration as index.The optimal strain persevation conditions were using 30%glycerol as protective agent stored at-64℃.The optimal strain activation was on the PDA medium with the first activation for 48 hours followed by the second for 24 hours.By taking into accounting of fermentation cost and the product concentration，the culture after 17-18 hours of seed fermentation was transferred to the fermentation tank of the optimal industrial fermentation medium，in which 20 g/L yeast and 40 g/L soy protein powder were added into the basic medium.By feeding ammonia water to maintain pH at 7.0±0.2 in the late fermentation stage and fermentation time extended to 72 hours，high-density fermentation could be achieved in the 100 L fermentation tank with cells>1×1014CFU/mL，more than 100 times of the conventional fermentation.

Bacillus amyloliquefaciens；preservation；activation；high-density fermentation

A

1674-5124（2017）05-0049-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.05.011

2017-03-04；

2017-04-20

科技部国际合作专项（2015DFR31060）

王涛（1980-），男，江苏徐州市人，高级工程师，主要从事生物源农药领域的原料药工艺技术开发研究。