核磁共振氢谱法测定甘露聚糖肽中多糖的含量

吴梦琪，张文清，徐志珍，宛燕飞，张 力，夏 玮*

(1.华东理工大学 上海市功能性材料化学重点实验室，上海 200237；2.成都利尔药业有限公司，四川 成都 610083)

核磁共振氢谱法测定甘露聚糖肽中多糖的含量

吴梦琪1，张文清1，徐志珍1，宛燕飞2，张 力2，夏 玮1*

(1.华东理工大学 上海市功能性材料化学重点实验室，上海 200237；2.成都利尔药业有限公司，四川 成都 610083)

以甘露聚糖肽为研究对象，首次采用1H-NMR法测定多糖产品中的多糖含量。以基准试剂邻苯二甲酸氢钾为内标，考察了弛豫延迟时间和采样次数对测定结果的影响。选定核磁共振参数弛豫延迟时间1 s，采样次数16次。考察结果表明，该方法具有很好的重复性和精密度。在对甘露聚糖肽定性鉴定的基础上，采用绝对定量方式测定了甘露聚糖肽实际样品的多糖含量，结果与苯酚-硫酸法一致。该方法专属性高，操作方便，结果准确，不仅可用于甘露聚糖肽中多糖含量的测定，还可用于其它结构明确的多糖含量测定。

核磁共振氢谱；多糖含量；甘露聚糖肽

甘露聚糖肽是我国首创的一种新型免疫促进剂，是将从健康人咽喉部分离的α-溶血性链球菌33号菌株经发酵、提取、精制而获得的一种糖肽类物质[1]。目前，甘露聚糖肽质量标准中的多糖含量采用传统的苯酚-硫酸法[2]进行测定，但该方法由于使用强腐蚀性酸，其危险系数高，操作较复杂，人为操作及测量误差不可避免，重现性差，且专属性不强。

核磁共振波谱是有机物定性的有力工具，由于1H-NMR中的共振峰面积与该共振峰所对应的质子数成正比，使得该方法可用于定量分析[3-4]。高强度磁场和傅立叶变换技术的应用使仪器性能得到较大改善，其测定准确度、重现性和灵敏度能满足定量要求，目前很多国家和地区已将NMR技术用于药物的定量分析和检测[5-7]，2010年中国药典新增了核磁共振波谱定量方法[8]。但是核磁共振波谱法用于多糖含量的测定至今未见报道。本文以甘露聚糖肽为研究对象，考察了NMR实验条件对测定结果的影响，建立了测定甘露聚糖肽中多糖含量的1H-NMR方法，并与传统方法的结果进行比较。实验结果为甘露聚糖肽质量标准的提高提供了科学依据，并为其他种类糖肽或多糖产品的多糖含量测定提供了参考方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DD2400-MR型核磁共振仪(安捷伦科技有限公司)；Mettler AE240型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Pipetman P100 100-1000 μL型微量移液枪(吉尔森公司)；甘露聚糖肽供试品(批号：131101，131102，G100102，成都利尔药业有限公司)；邻苯二甲酸氢钾(纯度>99.05%，国药集团上海化学试剂有限公司)；重水(氘代度：99.8%，北京希凯创新科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的制备 精密称取干燥的甘露聚糖肽供试品60 mg和内标物邻苯二甲酸氢钾10 mg，置于塑料离心管中，准确加入1.0 mL重水，超声至样品完全溶解，转移至5 mm核磁管中，待测。

1.2.2 核磁测定条件1H-NMR的共振频率为400 MHz，采样参数如下：脉冲序列(seqfil)：s2pul，扫描次数(ct)：16，空扫次数(ss)：0，谱宽(sw):8 012.8 Hz，脉冲角度(pw)：30，接收增益(gain)：10，测试温度(temp)：30 ℃，弛豫延迟时间(d1)：1.0 s，窗函数线宽因子(lb)：0 Hz。

1.2.3 甘露聚糖肽的定性鉴定 在优化条件下，测定添加内标物的甘露聚糖肽的1H-NMR谱，将异头氢区域谱图峰形和峰位移值与甘露聚糖肽标准品进行比对，采用相关系数法测定谱图相似度，采用Microsoft EXCEL软件分析所选定光谱区的数据，将供试品谱图的Y轴坐标与对照品图谱的Y轴坐标进行比较，计算相关系数ρ，若相关系数ρ>0.95，认为二者糖链结构一致；反之，则糖链结构不一致[9]。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 内标物的选择 核磁定量要求内标物具有化学性质稳定、不与溶剂和样品发生反应、纯度高、易称量以及信号峰不干扰样品测定等特质。核磁定量常用的内标物有：1,2,4,5-四氯苯、1,4-二硝基苯、对苯二酚、对苯二酸、邻苯二甲酸氢钾和苯甲酸苄酯等。由于甘露聚糖肽样品易溶于水，且邻苯二甲酸氢钾的化学位移在7.56～7.74之间，与甘露聚糖肽样品的信号完全分离，故实验采用易溶于水的邻苯二甲酸氢钾作为内标。

图1 添加内标物的甘露聚糖肽样品的1H-NMR谱图Fig.1 1H-NMR spectrum of mannatide adding internal standard

2.1.2 定量峰的选择 由于内标物的定量峰须与被测样品的信号峰完全分离，或者至少保证有一组峰完全分离，以保证积分结果的准确性。本实验选择邻苯二甲酸氢钾为内标，甘露聚糖肽供试品的1H-NMR谱图见图1。可观察到邻苯二甲酸氢钾的两组质子峰分别为：H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)和H-3,6(δ7.72～δ7.74,2H,dd)。本实验选择其中一组质子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作为内标物的定量峰。甘露聚糖肽样品的信号集中在3.20～5.80之间，主要分为两个区域：①异头氢区，5.80～4.40；②环质子区，4.40～3.20。其中，异头氢区的信号(4.88～5.35)不与其他氢信号重叠，且异头氢谱峰的化学位移值、峰形与甘露聚糖肽糖链结构重复单元中不同连接方式的糖残基一一对应，因此，本实验选择整个异头氢区域的谱峰(4.88～5.35)作为定量峰。

2.1.3 样品及内标物浓度的选择 待测样品和内标物的浓度要考虑样品的溶解性，并且需将样品和内标物的强度信号控制在具有可比性的范围内。如果待测样品和内标物之间的浓度差过大，会造成核磁信号的溢出，导致信号失真，手动积分时，最高信号面积的微小变化会引起显著的量化误差；而如果样品浓度过低，会导致积分结果误差偏大。本实验选择样品浓度为60 mg/mL，邻苯二甲酸氢钾浓度为10 mg/mL，此时样品的溶解性和流动性均较好，且从图1也可以看出，样品及内标物信号在可比范围内。

2.1.4 弛豫延迟时间的选择 以内标物邻苯二甲酸氢钾的一组质子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作为内标定量峰，设定其积分面积(Ar1)为2.000，考察了不同弛豫延迟时间(1，2，5，10，25 s)下，邻苯二甲酸氢钾的质子峰H-3,6(δ7.72～δ7.74,2H,dd)的积分面积(Ar2)。实验结果显示，随着弛豫延迟时间的增加，Ar2分别为2.003，2.005，2.009，2.015，2.025，其值略微增加，但各条件下Ar2值均接近其实际质子数，重现性较好，为节省时间，选择弛豫延迟时间为1 s。

2.1.5 扫描次数的选择 以内标物邻苯二甲酸氢钾的一组质子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作为内标定量峰，设定其积分面积为2.000，考察了扫描次数(2，4，8，16，32次)对甘露聚糖肽异头氢区域(δ4.88～δ5.35)谱峰积分面积(As)的影响。结果显示，采样次数较少时，重现性较差，当扫描16次以上时，As的数据重现性较好，继续增大扫描次数，As无明显提高，因此实验选择扫描16次。

2.2 甘露聚糖肽多糖含量的测定

2.2.1 定量公式的推导 根据1H-NMR中谱峰面积与该谱峰对应氢原子数成正比的原理，可知溶液中所有氢的吸收强度均相等，即Ar/MHr=As/MHs。式中，Ar为内标定量峰的积分面积；MHr为内标定量峰包含氢原子的摩尔数；As为供试品定量峰的积分面积；MHs为供试品定量峰包含氢原子的摩尔数[10]。等式左边内标物的计算比较简单直观，只需将称量的内标物质量Wr、内标定量峰包含氢原子的数目Nr以及内标物相对分子质量Mr代入，将左边算式变成Ar·Mr/(Nr·Wr)。等式右边反映的是甘露聚糖肽所有糖残基异头氢的情况，样品定量峰面积As以整个异头氢区域谱峰面积来表示。通过上述等式可得到样品中所有糖残基异头氢的摩尔数MHs。由于甘露聚糖肽的糖链部分由甘露糖和少量葡萄糖组成，甘露糖和葡萄糖均为六碳糖，相对分子质量均为180.155。样品中多糖的质量可用甘露糖和葡萄糖的总质量表示，多糖的质量Ws等于MHs·Ms，Ms值为180.155。进一步根据甘露聚糖肽样品的质量W，可以得到样品中多糖含量Ws%。

2.2.2 精密度试验 在优化条件下，取同一供试品溶液，连续测定6次，以内标物邻苯二甲酸氢钾的一组质子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作为内标定量峰，设定其积分面积为2.000，记录样品定量峰的积分面积(As)并计算相对标准偏差(RSD)。结果显示6次测定结果的RSD 为0.34%，表明该方法精密度良好。

2.2.3 重复性试验 在优化条件下，平行制备3份供试品(批号131101)溶液，以内标物邻苯二甲酸氢钾的一组质子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作为内标定量峰，设定其积分面积为2.000，记录样品定量峰积分面积(As)并计算供试品中多糖含量的RSD值。3份样品含量测定值的RSD 为0.71%，说明该方法重复性良好。

2.2.4 对不同批次样品的测定结果 采用核磁共振氢谱法对不同批次的甘露聚糖肽原料药样品进行测定，结果如表1所示，多糖含量分别为101%，100%，99.6%。说明该方法测定甘露聚糖肽原料药样品中的多糖含量可行且测定结果稳定。

表1 不同批次样品的测定结果Table 1 The measurement results of different batches of samples

同时采用苯酚-硫酸法对批号131101的原料进行测定，测得多糖含量为104%，两种方法的测定结果相一致。需要说明的是，为了提高该测定方法的专属性，应先采用核磁共振氢谱法进行定性鉴定，计算样品和甘露聚糖肽标准品的相似度，如果相关系数ρ>0.95，认为二者糖链结构一致,可进一步采用核磁共振氢谱法进行含量测定,否则由于样品中含有其他糖类物质或在异头氢区域有吸收的杂质,将会导致测定结果不能准确反映甘露聚糖肽的真实含量。另外核磁共振波谱法不仅局限于测定甘露聚糖肽的含量，其他多糖的含量如果结构明确也可以采用该方法进行测定。

3 结 论

本文建立了1H-NMR测定甘露聚糖肽中多糖含量的方法，所建立的方法专属性强，精密度高，重现性好，准确度高，且操作简便，可用于测定甘露聚糖肽的多糖含量。此外，该方法还可用于其它结构明确的多糖含量测定。

[1] Li S,Pan C,Xia W,Zhang W Q,Wu S Y.Int.J.Biol.Macromol.,2014,67:351-359.

[2] Jia R B,Lu L,Han C H,He J H,Xu G L.DrugStandardsofChina(贾瑞波，鹿麟，韩春晖，贺建华，徐桂连.中国药品标准)，2015，(4):271-274,275.

[3] Zhang Q，Zhu H B，Yang H X，Xiao X Y，Li X D.DrugStandardsofChina(张琪，朱红波，杨化新，肖新月，李晓东.中国药品标准)，2014,15(6):404-408.

[4] Lin S,Su J,Ye J,Cao B J,Zhang W D.J.Pharm.Pract.(林珊，苏娟，叶霁，曹邦静，张卫东.药学实践杂志)，2014,32(2):92-95,106.

[5] Guo Q S，Shi G Q，Song W，Xu X.J.Instrum.Anal.(郭强胜，石高旗，宋巍，许旭.分析测试学报)，2012,31(1):117-120.

[6] Zhang Y J，Liu X P.Chin.J.Magn.Reson.(张友杰，刘小鹏.波谱学杂志)，2007,24(3):289-295.

[7] Maniara G,Rajamoorthik K,Rajan S,Stockton G W.Anal.Chem.,1998,70:4921-4928.

[8] State Pharmacopoeia Commission.ChinesePharmacopoeia.Part 2.Beijing:Chemical Industry Press(国家药典委员会.中华人民共和国药典.2部.北京:化学工业出版社),2010.

[9] Abeygunawardana C,Williams T C,Sumner J S,Hennessey J P.Anal.Biochem.,2000,279:226-240.

[10] Cui T，Cheng J Q，Wang X K，Wang R F，Li X Y，An X N，Cui C，Gao Z.Mod.FoodSci.Technol.(崔同，陈剑桥，王晓科，王荣芳，李喜悦，安小楠，崔璨，高哲.现代食品科技)，2015,31(6):279-283,314.

Determination of Polysaccharide Content in Mannatide by1H-NMR

WU Meng-qi1,ZHANG Wen-qing1,XU Zhi-zhen1,WAN Yan-fei2,ZHANG Li2,XIA Wei1*

(1.Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China；2.Chengdu Lier Pharmaceutical Co.,Ltd.,Chengdu 610083,China)

A proton-nuclear magnetic resonance(1H-NMR) method was established for the determination of polysaccharide content in mannatide using potassium acid phthalate as the internal standard.Effects of some experiment parameters were investigated.The optimal conditions were selected as follows:relaxation delay time(d1):1 s；transient number(ns):16.The results indicated that,under the optimal conditions,the good precision and repeatability for the method were obtained.The polysaccharide content in mannatide, determined by the1H-NMR method with inner standard model,was similar to that of the ultraviolet spectrophotometry method.The established method was simple,specific and repeatable.Therefore,it could be used not only for the determination of polysaccharide content in mannatide,but also for detection of other kinds of polysaccharide with definite structures.

1H nuclear magnetic resonance；polysaccharide content；mannatide

2016-10-07；

2016-11-22

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.021

O482.532；O629.12

A

1004-4957(2017)05-0693-04

*通讯作者：夏 玮，博士，副教授，研究方向：天然产物的研究与应用，Tel：021-64253221，E-mail：xiawei1999@ecust.edu.cn