QuEChERS结合气相色谱-质谱法快速测定职业工人尿液中多溴联苯醚

郁 东，王德军，朱文文，陈 田，施致雄*

(1.山东省职业卫生与职业病防治研究院 检验科，山东 济南 250062；2.山东省疾病预防控制中心，山东 济南 250014；3.首都医科大学 公共卫生学院，北京 100069)

研究简报

QuEChERS结合气相色谱-质谱法快速测定职业工人尿液中多溴联苯醚

郁 东1，王德军2，朱文文1，陈 田3，施致雄3*

(1.山东省职业卫生与职业病防治研究院 检验科，山东 济南 250062；2.山东省疾病预防控制中心，山东 济南 250014；3.首都医科大学 公共卫生学院，北京 100069)

建立了QuEChERS前处理结合气相色谱-质谱快速测定职业工人尿液中8种多溴联苯醚同系物的分析方法。尿液样在氯化钠和无水硫酸镁的脱水与盐析作用下以正己烷-丙酮混合液提取，采用C18去除提取液中的杂质，并采用气相色谱-负化学源质谱法在选择离子监测模式下测定，内标法定量。三至七溴联苯醚在1～100 pg/μL(十溴联苯醚为10～1 000 pg/μL)范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。待测物在3个加标水平下的平均回收率为91.7%～110.2%，相对标准偏差(RSD)小于10%。多溴联苯醚的检出限为0.3～36 pg/mL。该方法简单快速，灵敏度和选择性较高，适合职业工人体内污染物暴露水平监测。

多溴联苯醚；尿液；气相色谱-质谱(GC-MS)；职业工人

溴系阻燃剂(BFRs)是一系列工业化学品，常添加于以电子电器产品为主的各类生产生活用品中用于防火阻燃，在预防火灾方面发挥了重要作用，但其在生产、使用和产品废弃过程中不断释放到周围环境中，并通过食物链富集放大，由此带来的环境污染和人群健康危害备受关注[1-2]。多溴联苯醚(PBDEs)自上世纪70年代开始应用，是迄今为止产量最大及使用时间最长的一类BFRs，但由于被发现具有环境持久性、远距离传输性及多种毒性效应[3-4]，2009年《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》缔约方大会已明确将PBDEs中的五溴和八溴联苯醚列为持久性有机污染物并建议禁用，PBDEs中毒性较低的十溴联苯醚虽然目前仍在生产与使用，但已有多国拟开展限用措施[5]。

BFRs的环境污染水平分析与人群暴露评估已成为当前的热点问题，但目前其在人群内的暴露评估以血清、母乳为主要基质[6-7]，极少涉及尿液中BFRs的监测。由于BFRs为脂溶性化合物，一般认为其在尿液中含量不高，但尿液样本具有易采集，对受试者无损伤等优点，因此可尝试将其作为职业工人体内污染物暴露水平评估的基质。在方法学上，当前针对液态样本中BFRs的测定多采用液液萃取法，但该方法溶剂消耗量大且程序复杂，亟需发展更简单快捷的前处理技术[8]。本研究采用QuEChERS前处理技术结合气相色谱-质谱建立了尿液中8种PBDEs 同系物的检测方法，并用于职业工人尿液的监测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-5977A气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司)；S-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司)。正己烷、丙酮、乙酸乙酯(色谱纯，美国J&T.Baker公司或迪马公司)；无水硫酸镁、氯化钠(优级纯，北京化工厂)；吸附剂N-丙基乙二胺(PSA)、C18(美国Agilent公司)。标准品：PBDEs标准溶液，包括美国环境保护署1614草案中列出的环境中优先关注的8种PBDEs单体(7种三至七溴联苯醚及十溴联苯醚)：BDE-28，47，99，100，153，154，183和209(质量浓度均为50 μg/mL，溶于异辛烷)；内标：3，3′，4，4′-四溴联苯醚(BDE-77)和2，2′，3，3′，4，4′-六溴联苯醚(BDE-128)(质量浓度 50 μg/mL，溶于异辛烷)。上述标准品均购于美国AccuStandard公司。同位素内标13C12-BDE-209(质量浓度 25 μg/mL，溶于甲苯)，购于美国Wellington Laboratories。

1.2 标准系列的配制

混标储备液：分别准确量取PBDEs各单体的标准液适量，混合后以正己烷稀释，得到浓度为1 μg/mL(其中BDE-209为10 μg/mL)的混合标准溶液，置于-18 ℃冰箱中冷冻保存。

标准溶液：取适量的上述混标储备液，以正己烷稀释，配成系列标准溶液，其中三至七溴联苯醚浓度为1～100 pg/μL，BDE-209浓度为10～1 000 pg/μL。标准溶液中，内标BDE-77和BDE-128的浓度为10 pg/μL，13C12-BDE-209 的浓度为100 pg/μL。置于-18 ℃冰箱中冷冻保存。

1.3 样品制备

取50 mL聚丙烯离心管，加入内标BDE-77和BDE-128各1 ng，13C12-BDE-209 10 ng，加标实验时需再加入不同浓度的待测物混合标准溶液，氮气吹干溶剂后，加入10 mL尿液，涡旋混匀。加入10 mL正己烷-丙酮混合液(体积比1∶1)，涡旋振荡1 min。再加入4 g 无水硫酸镁和1 g氯化钠，剧烈振荡1 min后，4 000 r/min离心5 min，上清液转移至15 mL聚丙烯离心管后氮吹至干，加入1 mL正己烷复溶，转移至已加入100 mg 无水硫酸钠和100 mg C18的2 mL离心管中。剧烈振荡1 min，4 ℃下10 000 r/min离心5 min。上清液经氮气吹干后加入100 μL正己烷复溶，待测。

1.4 气相色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：DB-5MS毛细管柱(15 m×0.25 mm×0.1 μm，美国Agilent公司)，色谱柱升温程序：100 ℃(保持1 min)，以20 ℃/min升温至300 ℃(保持6 min)，再以20 ℃/min升温至310 ℃(保持3 min)；载气为He(纯度>99.995%)，流速3 mL/min。不分流进样，进样量1 μL；进样口温度275 ℃，传输线温度300 ℃。

1.4.2 质谱条件 离子源为负化学源(NCI)；甲烷反应气压力0.2 MPa；离子源温度200 ℃，溶剂延迟时间5 min。扫描方式为选择离子监测(SIM)，BDE-209的定量离子为m/z486.6，定性离子为m/z488.6，13C12-BDE-209的定量离子为m/z494.6，定性离子为m/z492.6，其他待测物的检测离子均为m/z79和81。以BDE-77作为三至六溴联苯醚的内标，BDE-128作为BDE-183的内标，13C12-BDE-209作为BDE-209的内标。

2 结果与讨论

2.1 QuEChERS前处理方法优化

2.1.1 萃取溶剂的选择 QuEChERS前处理技术具有回收率高、操作简便等优点，是近年来发展非常迅速的一种新兴样品前处理技术[9]。前处理方法的第1步是采用有机溶剂萃取待测液，乙腈由于萃取效率较高常被作为萃取溶剂[9]，萃取过程中加入无水硫酸镁和氯化钠除水并起到盐析作用。本文采用对加标尿液(三至七溴联苯醚0.1 ng/mL，BDE-209 1 ng/mL)进行萃取测试加标回收率的方式比较了多种有机溶剂或混合有机溶剂的萃取效果，包括乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷-丙酮(体积比1∶1)、甲基叔丁基醚、正己烷-甲基叔丁基醚(体积比1∶1)等。发现对于尿样，以乙酸乙酯、丙酮、甲基叔丁基醚及正己烷-甲基叔丁基醚混合液作为萃取溶剂时，有机相与无机相即使高速离心后也无法分离。使用乙腈、正己烷和正己烷-丙酮混合液萃取时，有机相与无机相可完全分层，但正己烷的萃取回收率偏低(约50%)，采用乙腈或正己烷-丙酮萃取时，待测物的回收率良好(80%以上)，但乙腈萃取时有机层明显比正己烷-丙酮萃取时的颜色深，可见乙腈萃取时会有更多杂质被萃取出。此外，由于PBDEs为低极性的脂溶性化合物，采用含低极性正己烷的混合溶剂更有利于提高萃取效率[1]，且乙腈毒性较大，因此后续采用正己烷-丙酮混合液为萃取溶剂。

2.1.2 吸附剂的选择 QuEChERS前处理方法的第2步是加入N-丙基乙二胺(PSA)或C18等吸附剂通过吸附作用去除萃取液中的杂质。PSA具有WAX功能团，能有效去除非极性基质中的糖、脂肪酸等极性化合物[10]，但其去除脂肪能力较弱；C18可有效去除萃取液中的脂肪类杂质[11]，如果样本中脂肪的含量超过2%，则适合采用C18作为吸附剂。本文通过对尿液进行加标回收率实验比较了PSA(100 mg)、C18(100 mg)和PSA/C18混合物(各50 mg)的吸附效率。结果发现经上述3种吸附剂净化后，所有待测物的回收率均较好且差别不大。考虑到C18价格远低于PSA，适于大批量样本的分析，因此选择C18为吸附剂。在后续实验中优化了C18的使用量(100～500 mg)，由于尿液中脂肪含量很低，100 mg C18已有足够的吸附杂质效果，且各化合物的回收率均较好(90%～115%)，而随着C18使用量的增加回收率并无明显变化，故后续实验中C18的使用量均为100 mg。

2.2 GC-MS方法的优化

PBDEs为含溴的半挥发性化合物，多采用气相色谱结合负化学源质谱(GC-NCI/MS)进行分析[12-13]。气相色谱分离时由于BDE-209易在高温下脱溴降解，故采用短色谱柱(≤15 m)以缩短保留时间。本文采用15 m毛细管色谱柱进行气相色谱分离，所有待测物均可获得良好的响应。NCI/MS是测定PBDEs的最常用方法。在NCI源中三至七溴联苯醚产生的离子主要为溴离子(m/z79和81)，BDE-209 产生的主要碎片离子则是分子离子丢失1个五溴苯后形成的C6Br5O-(m/z486.6)，故可以采用同位素内标13C-BDE-209进行精确的定量分析[14]。

2.3 方法验证

2.3.1 标准曲线与检出限 按照“1.4”方法采集各标准溶液的谱图，以各待测物与相应内标峰面积的比值(x)为横坐标，各待测物与内标浓度的比值(y)为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程与相关系数(r)。标准溶液的质量色谱图如图1所示，各化合物的保留时间、线性方程和相关系数结果见表1。结果显示，当三至七溴联苯醚浓度为1～100 pg/μL，十溴联苯醚浓度为10～1 000 pg/μL时，标准曲线的线性良好，相关系数均大于0.999。以10 mL经检测无待测物残留的普通人尿样为基质，测定最低加标水平的响应，计算信噪比，以信噪比为3对应的浓度为方法检出限(LOD)，三至七溴联苯醚由于在NCI源上响应较高，LOD均在2 pg/mL以下，十溴联苯醚由于存在高温分解情况其LOD较高(36 pg/mL)(见表1)。

2.3.2 加标回收实验 以普通人尿液为空白基质进行加标回收试验，空白尿液中BDE-28，47，99，100和154的浓度控制在1 pg/mL以下，BDE-153和BDE-154的浓度控制在2 pg/mL以下，BDE-209则在40 pg/mL以下。尿液取样量10 mL，加标水平分别为0.01，0.1,1.0 ng/mL(其中BDE-209的加标水平分别为0.1，1.0,10 ng/mL)，平均加标回收率及相对标准偏差(RSD)结果见表2。结果显示，PBDEs的平均回收率为91.7%～110.2%，RSD均小于10%，表明方法的精密度和回收率良好。

图1 BFRs标准溶液的质量色谱图Fig.1 Chromatogram of BFRs standard solution concentrations of BDE-77，BDE-128 and tri- to hepta-BDEs were 10 pg/μL，BDE-209 and 13C12-BDE-209 were 100 pg/μL

AnalyteRetentiontime(min)Linearrange(pg/μL)Regressionequationr2LOD(pg/mL)BDE-28(2，4，4′⁃三溴联苯醚)5 9051～100y=1 1712x+0 02610 99920 4BDE-47(2，2′，4，4′⁃四溴联苯醚)6 9061～100y=1 0361x+0 03250 99910 3BDE-100(2，2′，4，4′，6⁃五溴联苯醚)7 6171～100y=1 0830x+0 02610 99950 7BDE-99(2，2′，4，4′，5⁃五溴联苯醚)7 8631～100y=0 9651x+0 01560 99980 6BDE-154(2，2′，4，4′，5，6′⁃六溴联苯醚)8 4141～100y=1 0770x+0 03620 99960 7BDE-153(2，2′，4，4′，5，5′⁃六溴联苯醚)8 7291～100y=1 0540x+0 04250 99951 1BDE-183(2，2′，3，4，4′，5′，6⁃七溴联苯醚)9 5161～100y=1 8410x+0 03980 99921 7BDE-209(十溴联苯醚)13 18510～1000y=1 0238x+0 15620 999536

*spiked concentration of BDE-209 were 0.1，1.0,10 ng/mL,respectively

2.4 方法应用

按照本方法测定了2016年采自山东某溴系阻燃剂生产厂BDE-209生产车间的10份工人尿样；同时还测定了采自北京某高校学生的10份尿样进行比对。在10份学生尿样中均未检出待测物。职业工人尿样中有一样本检出了较高浓度的BDE-47，BDE-99，BDE-154和BDE-153，浓度为4.8～40.8 pg/mL，但其它尿样中均未检出三至七溴联苯醚，在所有10份工人尿样中均检出BDE-209，浓度为0.42～18.2 ng/mL，平均值为4.25 ng/mL。图2为检出十溴联苯醚的某车间工人尿样的质量色谱图。至今为止涉及尿液中BFRs含量分析的文献极少，Chen等[15]测定了采集自广东的新生儿尿液样本，其中总PBDEs含量在

图2 检出十溴联苯醚的车间工人尿样的色谱图Fig.2 Chromatogram of an urine sample from decabrominated diphenyl ether manufacturing worker

3 结 论

本文以QuEChERS技术和气相色谱-负化学源质谱法为基础，建立了尿液中8种多溴联苯醚同系物的前处理和检测方法，在对前处理方法和仪器分析条件进行优化的基础上开展了职业工人尿液的检测。结果表明QuEChERS技术能有效地提取尿液中的待测物并去除杂质。NCI/MS测定PBDEs也获得了较高的灵敏度和良好的选择性。本方法简便快速，在职业工人暴露水平监测方面具有较好的应用前景。

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Rapid Determination of Polybrominated Diphenyl Ethers in Urine of Occupational Worker Using QuEChERS Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

YU Dong1， WANG De-jun2， ZHU Wen-wen1， CHEN Tian3,SHI Zhi-xiong3*

(1.Department of Laboratory Medicine，Shandong Academy of Occupational Health and Occupational Medicine， Jinan 250062，China；2.Shandong Center for Disease Control and Prevention，Jinan 250014，China； 3.School of Public Health，Captical Medical University，Beijing 100069，China)

A method for the analysis of polybrominated diphenyl ethers(PBDEs) in urine of occupational worker was developed using QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe) pretreatment coupled to gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Urine sample was extracted with an acetone-hexane mixture by dehydration and salting-out using NaCl and anhydrous MgSO4.The purification was performed with C18particlet,and GC-MS determination was perfomed under negative chemical ionization(NCI) mode.The calibration curves were linear in the ranges of 10-1 000 pg/μL for BDE-209，and 1-100 pg/μL for the rest of analytes，with correlation coefficients higher than 0.999 .The average recoveries were in the range of 91.7%-110.2% at three spiked levels，with relative standard deviations lower than 10%.The limits of detection(LOD) of PBDEs ranged from 0.3 pg/mL to 36 pg/mL.This method was validated to be simple，sensitive and selective，and was suitable for the exposure accessment of pollutant in occupational workers.

polybrominated diphenyl ethers(PBDEs);urine;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);occupational worker

2016-12-26；

2017-01-23

国家自然科学基金(21477083)；山东省医药卫生科技发展计划项目(2013WS0159)；首都医科大学校自然科学基金(2016ZR01)；北京市自然科学基金(7122022)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.010

O657.71;O625.13

A

1004-4957(2017)05-0640-05

*通讯作者：施致雄，博士，副教授，研究方向：环境分析化学，Tel:010-83911775，E-mail:szx0127@ccmu.edu.cn