核蛋白Sam68的原核表达及鉴定

张华，陈宁，丁筠，邹德华，潘子夜，李鹏飞，李丽阳，肖丽杰，曹宏伟

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.哈尔滨医科大学附属第五医院肾内科）

核蛋白Sam68的原核表达及鉴定

张华1，陈宁1，丁筠1，邹德华1，潘子夜1，李鹏飞2，李丽阳1，肖丽杰1，曹宏伟1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.哈尔滨医科大学附属第五医院肾内科）

为了构建pGEX-4T-1-Sam68原核表达载体，表达并鉴定GST-Sam68融合蛋白，采用PCR扩增Sam68基因，插入pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I位点，并转化Rosetta（DE3）大肠杆菌，IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达，GST pull-down技术验证Sam68的结合活性。酶切和测序结果证实Sam68基因正确插入pGEX-4T-1载体中，载体能够在Rosetta（DE3）细胞中正确表达，且纯化的GST-Sam68蛋白具有与PI3K p85特异结合的活性，说明成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Sam68。

Sam68；原核表达；载体构建；鉴定

Sam68（Src associated in mitosis 68 kDa，Sam68）属于RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）信号转导与RNA活化蛋白家族（signal transduction and activation of RNA，STAR）成员，是酪氨酸激酶Src的靶蛋白，在细胞增殖和分化过程中发挥着重要的作用，可调控细胞周期进程及细胞凋亡[1]。Sam68表达广泛，在信号转导，基因转录和选择性剪接中起着重要的作用，与细胞内的许多信号分子，包括Src、Grb2、Grap、SHP-1、PLCγ1/Fyn、BRK和PI3K等存在相互作用，参与T细胞受体、胰岛素受体信号转导及Ras和PI3K激酶途径[2-3]。实验观察表明，Sam68与多种肿瘤发生、信号转导途径相关，特别是在内分泌有关的癌症中Sam68发挥着关键作用[4]。同时，近期研究也发现Sam68在脂肪细胞和神经元的发育过程中也扮演着重要的角色，与骨质疏松、肥胖、不孕不育、性共济失调及神经系统疾病也存在着一定的关系[5-7]。为了进一步了解Sam68在肿瘤细胞增殖、凋亡中的作用及其信号转导中的功能，我们构建了Sam68的原核表达载体，并在Rosetta细胞中进行了表达、纯化、Western验证及结合活性检测，为后续研究Sam68在肿瘤细胞增殖、凋亡中的作用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

鼠单克隆抗GST抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠和羊抗兔抗体购自北京中衫金桥生物技术公司；兔单克隆抗Sam68抗体购自Epitomics公司；兔抗PI3K p85抗体购自CST公司；GST beads购自Abmart公司；DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购于Omega公司；PCR试剂盒、限制性内切酶、Solution I连接酶购自TaKaRa公司；高保真pfu聚合酶购自NEB公司；引物合成和序列测定由Invitrogen公司完成；感受态细胞DH5α、Rosseta（DE3）购自博迈德公司；pEGFP-Sam68与pGEX-4T-1载体由实验室保存。

1.2 引物设计

根据NCBI GenBank（Accession No.：NM_006559）所提供的Sam68基因序列设计引物，正向引物：5'CGGAATTCATGCAGCGCCGGGACGACCCCGCCG3’（EcoRI），反向引物：5'GCGTCGACCTAATAACGTCCA TATGGGTGC3’（Sal I），拟将Sam68基因片段插入pGEX-4T-1的EcoR I/Sal I位点。

1.3 Sam68基因的PCR扩增

以pEGFP-Sam68为模板，扩增Sam68基因，PCR体系：10×pfu缓冲液5 μL，2.5 mM dNTP混合液4 μL，20 mM 10×Mg2SO42.5 μL，模板cDNA＜500 ng，正向引物0.5 μM，反向引物0.5 μM，5 U·μL-1NEB pfu酶0.25 μL，反应体系50 μL。PCR反应条件为：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个反应循环，72℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带回收，PCR产物送Invitrogen公司测序，正确的片段-20℃保存备用。

1.4 pGEX-4T-1-Sam68的构建及鉴定

将PCR获得的Sam68片段与pGEX-4T-1载体，分别37℃EcoR I/Sal I双酶切过夜，胶回收，然后按照载体与片段摩尔比1∶6的比例，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，固体LB培养基培养12～16 h，挑菌接种试管培养12～16 h，菌液PCR鉴定为阳性克隆后，抽提质粒，送Invitrogen公司测序，将正确重组质粒命名为pGEX-4T-1-Sam68，-20℃保存备用。

1.5 蛋白表达与纯化

将pGEX-4T-1-Sam68质粒转化Rosseta（DE3），方法同1.2.3。挑取阳性克隆接种至20 mL LB培养基37℃活化12～16 h，然后将20 mL菌液接种至2 000 mL LB培养基37℃培养2～3 h至菌液吸光度OD 0.6～0.8，加入0.1 mM IPTG，16℃低温诱导16～24 h，SDS验证蛋白的表达。诱导的菌液4 000 rpm 10 min，用50 mL缓冲液（100 mM Tis-Hcl，50 mM NaCl）重悬菌体，超声破碎菌体，12 000 rpm 30 min,收集上清，0.22 μm滤膜过滤，4℃备用。GST珠子先用高pH缓冲液（0.1 M Tris，0.5 M NaCl，pH8.0）和低pH值缓冲液洗涤（0.1 M NaAc，0.5 M NaCl pH4.5）各3个柱体积，重复3次，然后用缓冲液平衡5个柱体积，1 mL·min-1上样，用10个柱体积缓冲液洗去杂蛋白，最后用，5个柱体积的Elution Buffer（20 mM还原型谷胱甘肽）洗脱目的蛋白。收集纯化的GST-Sam68蛋白，用50 KD的超滤杯进行浓缩，SDS-PAGE检测浓缩效果。

1.6 Western Blot检测

目的蛋白加入SDS loading buffer后，煮沸10 min，12 000 g 10 min，12%SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶封闭2 h，用小鼠抗GST单克隆抗体室温孵育1 h，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，曝光，拍照。

1.7 GST pull-down实验

500 μL PBS洗GST Beads 2次，加入GSTSam68蛋白，4℃孵育2小时，4℃离心，PBS洗2次，弃上清。加入细胞裂解上清，4℃孵育2小时，PBS洗2次。吸走剩余PBS，留20 μL左右，加入5×上样Buffer，沸水煮10 min，12 000 g离心10 min，SDSPAGE，Western Blot检测Sam68与PI3K 85亚基的相互作用。SDS-PAGE，Western Blot方法同上，其中，Western Blot选用的是兔抗PI3K p85抗体。

2 结果

2.1 Sam68的PCR扩增结果

pEGFP-Sam68质粒带有Sam68基因，我们以pEGFP-Sam68质粒为模板，设计特异性引物，PCR扩增Sam68基因，图1显示PCR所扩增的片段大小约为1 332 bp，与预计大小相符，为特异的Sam68片段。

图1 Sam68 PCR扩增结果Fig.1The resultant PCR amplification of Sam68

2.2 pGEX-4T-1-Sam68的酶切鉴定及序列测定

将构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-Sam68，经EcoR I和Sal I双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，图2显示酶切片段Sam68约为1 332 bp，与预计大小相符。对重组质粒pGEX-4T-1-Sam68目的基因片段进行DNA序列测定，结果显示，DNA序列及阅读框完全正确，这些结果说明我们成功构建了真核表达载体pGEX-4T-1-Sam68。

图2 pGEX-4T-1-Sam68限制性酶切分析Fig.2Restriction endonuclease analysis of pGEX-4T-1-Sam68

2.3 SDS-PAGE检测GST-Sam68蛋白的表达与纯化

转化pGEX-4T-1-Sam68质粒的重组菌在不同时间点诱导表达产物经SDS-PAGE分析，在相对分子质量约95 kDa处可见明显条带，而空载体重组菌的诱导表达产物则无此条带。图3显示，此重组菌中GSTSam68能特异性地表达，表达大小与预期的相符。该蛋白经过GST珠子四轮纯化，获得了GST-Sam68的纯化蛋白。收集纯化的GST-Sam68蛋白，用50 kDa的超滤杯进行浓缩，SDS-PAGE进行检测（line 8）。

图3 GST-Sam68蛋白的表达与纯化Fig.3Expression and purification of GST-Sam68 protein

2.4 Western blot检测GST-Sam68蛋白的表达

表达纯化的目的蛋白，用鼠抗GST单克隆抗体检测GST-Sam68重组融合蛋白。图4结果显示，表达的GST-Sam68重组融合蛋白，特异性结合鼠抗GST单克隆抗体，蛋白大小约为95 kDa，蛋白与预计大小相符，说明我们构建的原核表达载体能够正确表达出融合蛋白GST-Sam68。

图4 Western Blot鉴定GST-Sam68融合蛋白Fig.4Western Blot analysis of GST-Sam68 fusion protein

2.5 Sam68与PI3K的结合活性

Sam68是一种接头蛋白，与细胞内诸多蛋白存在相互作用，为了验证所表达的GST-Sam68的结合活性，我们选取GST pull-down来研究Sam68对PI3K p85的结合活性。图5结果显示，GST-Sam68能够将PI3K p85 pull-down下来，而对照却不能将PI3K p85 pull-down下来，说明GST-Sam68融合蛋白具有与PI3K p85特异性结合的活性，结果说明我们纯化的GST-Sam68是具有蛋白结合活性的。

图5 GST pull-down分析GST-Sam68Fig.5GST pull-down analysis of GST-Sam68

3 讨论

Sam68不仅在调控RNA的代谢过程中发挥着重要作用，同时Sam68还调控着CD44、Bcl-xl、Sgce、Cyclin D1和mTOR等基因的RNA选择性剪接[8-11]。Sam68作为一个接头蛋白，通过其富含脯氨酸的基序及SH2、SH3和WW结构域与许多信号转导蛋白相互作用，如Src、BRK、PI3K、FBP21和FBP30[12-15]。此外，Sam68还是TNF-α诱导NF-κB的活化和细胞凋亡的必须因子[16]。多项研究表明，在多种人类癌症中Sam68的表达上调，包括前列腺癌，肾细胞癌和乳腺癌，Sam68可能作为一个致癌基因，促进肿瘤发展及转移[17-18]。Sam68的表达和细胞质定位与早期宫颈癌患者淋巴结转移及预后相关[19]，是肾细胞癌的一个重要和独立的预后标志物[20]，Sam68高水平表达和核定位常预示着结肠癌的发展和预后不良[2]。鉴于Sam68在信号转导方面的重要功能，为了进一步研究Sam68在调控细胞生长中的作用，研究构建了Sam68与GST蛋白的融合原核表达载体，并表达纯化了GSTSam68蛋白。诱导表达后的结果显示：Sam68在Rosseta感受态中能够正确表达，证明构建和诱导表达都是成功的。在高效表达GST-Sam68融合蛋白后，采用文献报的GST珠子，对蛋白进行了纯化[21]，而且获得了纯化的蛋白，并对获得的纯化蛋白进行了鉴定，GST pull-down实验也证实了融合蛋白GST-Sam68具有特异性结合PI3K p85的活性，证实Sam68在信号转导中的作用。研究获得的纯化蛋白，为我们进一步研究Sam68在信号转导中的作用奠定了一定的基础。

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Prokaryotic Expression and Identification of Nuclear Protein Sam68

Zhang Hua1，Chen Ning1，Ding Yun1，Zou Dehua1，Pan Ziye1，Li Pengfei2，Li Liyang1，Xiao Lijie1，Cao Hongwei1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Departement of Nephrology，The Fifth Affiliated Hospital of Harbin Medical University）

In order to prokaryotically express and identify the nuclear protein Sam68，Sam68 gene fragment was firstly amplified by PCR.The PCR product was cloned into EcoR I and Sal I site of pGEX-4T-1.The recombinant vector pGEX-4T-1-Sam68 was transformed into Rosetta（DE3），and competent cells were induced by IPTG to express the fusion protein.GST beads were used for purifying the GST-Sam68 fusion protein.SDS-PAGE and Western blot were used for identification of the fusion expression.GST pulldown was performed for detection of binding activity of GST-Sam68.Restriction endonuclease digestion and sequence analysis confirmed that Sam68 was inserted into pGEX-4T-1，and the vector expressed the GST-Sam68 fusion protein correctly.The purified GST-Sam68 fusion protein could bind to PI3K p85，suggesting that prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-Sam68 had been constructed successfully.

Sam68；prokaryotic expression；construction of vector；identification

Q78

A

1002-2090（2017）03-0073-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.016

2016-04-06

国家自然科学基金（31300145、31570159）；黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（12541578）;中国博士后科学基金面上项目（2016M590297）;黑龙江省政府博士后资助经费（LBH-Z15188）；黑龙江八一农垦大学博士科研启动基金（XDB2015-16）。

张华（1979-），男，副教授，中国科学院毕业，现主要从事分子免疫学、分子病毒学方向的研究工作。

曹宏伟，女，教授，硕士研究生导师，E-mail：hettieluck@hotmail.com。