连翘乙酸乙酯提取物体外抗氧化活性研究

黄春阳， 郑鸿娟， 零新岚， 梁华益， 黄春佳， 黄锁义

(1.右江民族医学院 临床医学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院 检验学院，广西 百色533000；3.右江民族医学院 药学院，广西 百色 533000;4.右江流域特色民族药研究广西高校重点实验室，广西 百色 533000)

连翘乙酸乙酯提取物体外抗氧化活性研究

黄春阳1， 郑鸿娟1， 零新岚2， 梁华益1， 黄春佳1， 黄锁义3，4*

(1.右江民族医学院 临床医学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院 检验学院，广西 百色533000；3.右江民族医学院 药学院，广西 百色 533000;4.右江流域特色民族药研究广西高校重点实验室，广西 百色 533000)

目的：研究连翘乙酸乙酯提取物的体外抗氧化活性，为其充分开发利用提供理论依据。方法：以乙酸乙酯为溶剂制备连翘乙酸乙酯提取液，通过分光光度法测定其对DPPH自由基的清除能力、用普鲁士蓝法测定其还原Fe3+的能力，并以丁基羟基茴香醚(BHA)为对照品测定连翘乙酸乙酯提取物对金属亚铁离子(Fe2+)的螯合能力。结果：连翘乙酸乙酯提取物具有较强的DPPH自由基的清除能力和还原Fe3+能力，对亚铁离子(Fe2+)的螯合能力强。结论：连翘乙酸乙酯提取物的抗氧化能力强，且随样品液的浓度升高而增强，呈现良好的线性关系。

连翘；乙酸乙酯提取物；体外；抗氧化

连翘[Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl]为木犀科(Oleaceae)连翘属植物，又名黄花条、连壳等，系多年生落叶灌木，其性微寒，味苦，归肺、心、胆经，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效，临床常用于急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结核、尿路感染等症，中医素有“疮家圣药”之称[1]。其果实内含木脂素、黄酮、环己乙醇衍生物、三萜和神经酰胺等多种化合物[2]。现代医学已证实氧化性应激与多种疾病的发生有关, 其中包括自身免疫性疾病、糖尿病、白内障、癌症等的产生与发展都可由自由基及其代谢产物诱发。因此具有抗氧化活性的药物引起了广泛关注。有研究曾以甲醇及乙醇为溶剂探究其提取物抗氧化活性[3-4]，而采用乙酸乙酯为溶剂研究其提取物的抗氧化活性未见报道。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

1.1.1 仪器

植物粉碎机FZ102(上海锐丰仪器仪表有限公司)、电子分析天平JA2003(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、电热式恒温水浴锅HHS-21-4(江苏金坛宏凯仪器厂)、旋转蒸发器RE-5299(上海振捷实验设备有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A(上海精宏实验设备有限公司)、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、752型紫外可见分光光度计(上海精学科学仪器有限公司)、80-2离心沉淀器(江苏省金坛市医疗仪器厂)。

1.1.2 试剂与药材

乙酸乙酯、DPPH、无水乙醇、硫酸亚铁、BHA、菲啰嗪、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等均为分析纯，连翘果实采购自百色药店。

1.2 方法与结果

1.2.1 连翘乙酸乙酯提取液的制备

称取50 g连翘干粉，500 mL乙酸乙酯中浸泡1 h后于80 ℃恒温水浴锅冷凝回流提取2 h，抽滤，滤液于旋转蒸发器中减压浓缩制成浸膏，准确称取1 g浸膏以乙酸乙酯溶解并定容至100 mL容量瓶，配成不同浓度样品液以备用。

1.2.2 连翘乙酸乙酯提取物对DPPH自由基的清除能力测定[5]

DPPH为1,1-二苯基-2-苦肼基自由基的简称，在有机溶剂中为一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，具有单一电子或氢离子，于波长517 nm下有最大吸收。自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降呈线性关系，因此可借紫外/可见分光光度计来检测自由基被捕捉的情形，从而评价样品的抗氧化能力。以50%清除率时样品溶液浓度(IC50)衡量样品清除自由基能力，IC50越小表明清除能力越强[6]。

实验方法参照文献[5]并稍加改动。取5支10 mL具塞比色管，各加0.5 mL浓度为0.6 mmol/L的DPPH溶液，再分别加浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL样品液各1 mL，无水乙醇定容至10 mL，混匀后室温暗光下反应30 min，以无水乙醇调零于波长为517 nm的分光光度计下测定其吸光度。平行测定3次。

清除率(%)=[(A1-A2)/A1]×100%

A1:空白吸光度(t=0 min)

A2:反应30 min后吸光度

图1 连翘乙酸乙酯提取液对DPPH·的清除率

实验结果如图1，在一定浓度范围内随样品浓度增大其清除率也随之增强，浓度为1.0 mg/mL时清除率高达71.39%，已超过IC50，表明连翘乙酸乙酯提取物对DPPH自由基具有很强的清除能力。

1.2.3 连翘乙酸乙酯提取液还原能力测定[7]

溶液中存在还原剂时，Fe3+和铁氰化物复合物会接受还原剂给出的电子转化为Fe2+形式的化合物，进而两者反应生成普鲁士蓝{Fe4[Fe(CN)6]3}，其在700 nm处有最强吸收峰，溶液颜色由原来的黄色变成不同程度的绿色-蓝色，故测定700 nm处的吸光度值即可测定亚铁离子浓度。吸光度值越大，还原力越强。

根据文献[7]报道的实验方法测定。取5支大试管，向各管加浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL样品液1 mL、 pH=6.6磷酸缓冲溶液2.5 mL、无水乙醇2 mL以及2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀并于50 ℃恒温水浴锅水浴20 min，取出后分别加10%三氯乙酸2.5 mL，于4 000 r/min离心机离心10 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁2.5 mL，混匀，静置10 min，于波长700 nm分光光度计下测定吸光度。平行测定3次。

图2 连翘乙酸乙酯提取液还原能力

实验结果如图2，在一定浓度范围内，随着样品浓度的增大其还原能力也随之增强，表明以乙酸乙酯为溶剂的连翘提取物具有很强的还原能力。

1.2.4 连翘乙酸乙酯提取物对金属亚铁离子(Fe2+)的螯合能力测定[5]

分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL浓度为0.2 mg/mL的样品液及对照品BHA于10 mL具塞比色管中，加0.2 mol/L硫酸亚铁0.1 mL，混匀，再加入5 mmol/L菲啰嗪0.2 mL，无水乙醇定容至5 mL，剧烈震荡后室温静置10 min，以无水乙醇调零于波长为562 nm分光光度计下测定吸光度。

螯合率(%)=[(A0-A1)/A0]×100%

A0:不加样品(或对照品BHA)

A1:加入样品(或对照品BHA)

图3 连翘乙酸乙酯提取液和 BHA对金属亚铁离子(Fe2+)螯合能力

实验结果如图3，一定浓度下的样品液及对照

品BHA随着加入体积的增大其对金属亚铁离子(Fe2+)的螯合能力也随之增强，且同等浓度和体积下的样品液对金属亚铁离子(Fe2+)的螯合能力强于BHA，表明连翘乙酸乙酯提取物对金属亚铁离子(Fe2+)具有很强的螯合能力。

2 结 论

实验研究表明连翘乙酸乙酯提取物对DPPH自由基的清除能力、还原能力、对金属亚铁离子(Fe2+)的螯合能力均具有较好的作用，且其螯合能力比对照品(BHA)强。实验结果表明连翘乙酸乙酯提取物具有较强的抗氧化能力，且其抗氧化能力在一定的样品浓度范围内呈现良好的量效关系。连翘资源丰富，生物活性多样，临床用途广泛，疗效确切，毒副作用低，具有抗菌、抗病毒作用，对急性肾炎、肺结核、视网膜黄斑区出血、呃逆、便秘等都具 有一定的作用，此外还有镇吐、解热、抗炎以及肝脏保护等作用[8]，因此很有发展前途。本实验研究连翘果实乙酸乙酯提取物的抗氧化活性，可充分提取其有效的化学成分，并利用无水乙醇作为中间介质，解决了实验过程中出现的乙酸乙酯及其提起液不溶于水等其他溶液而分层的现象，为连翘的综合开发利用提供理论依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：159-160.

[2] 邹琼宇，邓文龙，蒋舜媛，等.连翘果实中的化学成分研究[J].中国中药杂志，2012，37(1)：57-60.

[3] 秦宇，张文丽，林媛媛，等.连翘化学成分与抗氧化活性研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(10)：149-152.

[4] 吴艳芳，王新胜，陈蓉，等. 连翘药材提取物体外清除自由基的作用[J].新乡医学院学报，2012，29(3)：172-173，176.

[5] 李远辉，郭圣奇，黄挺章，等. 薏苡叶乙酸乙酯提取物的体外抗氧化活性研究[J].时珍国医国药，2015，26(5)：1051-1053.

[6] 柳爱莲，刘绣华.天然产物抗DPPH自由基活性研究[J].周口师范学院学报，2007，24(5)：80-82.

[7] 余珊，司珂珂，尤萍，等.广西壮药薏苡叶多糖的提取及体外抗氧化性研究[J]．食品工业，2012，33(10) :57-59.

[8] 简永耀，靳龙文. 连翘的化学成分及药理学研究[J]. 淮海医药，2009，27(4)：349-350.

Study of Antioxidant Property of the Extract fromForsythiasuspenseEthyl Acetate

Huang Chunyang1，Zheng Hongjuan1，Ling Xinlan2，Liang Huayi1，Huang Chunjia1，Huang Suoyi3，4*

(1. School of Clinical Medicine, Youjiang Medicine University for Nationalities, Baise 533000,China;2. School of Clinical Laboratory Medicine, Youjiang Medicine University for Nationalities,Baise 533000,China; 3. School of Pharmacy, Youjiang Medicine University for Nationalities,Baise 533000,China; 4.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of the Characteristics of Ethnic Medicine of the Youjiang Valley, Baise 533000, China)

Objective：To study the antioxidant activityinvitroof extract fromForsythiasuspenseethyl acetate, so as to provide theoretical foundations for the full development and utilization. Methods：Ethyl acetate was used as the solvent to prepareForsythiasuspenseethyl acetate extracting solution. Spectrophotometry was employed to test its scavenging activity toward DPPH free radical, while Prussia was used to test its ability of restoring Fe3+. Also, butyl hydroxyl anisd (BHA) was used as reference substance to test the chelating ability ofForsythiasuspenseethyl acetate extract toward Fe2+. Results:Forsythiasuspenseethyl acetate extract has relatively strong ability of scavenging DPPH free radica and restoring Fe3+, as well as chelating Fe2+. Conclusion：Forsythiasuspenseethyl acetate extract has a strong antioxidant activity, which increases with the concentration of sample solution and appears favorable linear relations.

Forsythiasuspense; extracts of ethyl acetate;invitro;antioxidant

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.005

2016-04-02

黄春阳(1991—)，女，本科在读。研究方向：中药有效成分提取。E-mail：huangchunyangy@163.com

国家中医药管理局"十二五"中医药重点学科中药化学建设项目(国中医药人教发[2012]32号)；广西重点学科药物化学建设项目(桂教科研[2013]16号)；广西高校科技创新能力提升工程建设项目和右江流域特色民族药研究广西高校重点实验室项目(桂教科研[2014]14号)；右江民族医学院大学生创新研究团队校级科研课题资助项目(右医科字[2014]2号)；广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室开放课题(kfkt2016043)。

Q946

A

1006-9690(2017)01-0015-03

*通讯作者： 黄锁义(1964—)，男，教授，硕士研究生导师。研究方向：天然产物化学、药物化学、食品卫生、中草药与植物化学。E-mail：huangsuoyi@163.com