高选择性肼比率荧光探针的设计合成及分析应用

侯明萱，柳彩云

(1.山东省实验中学，山东 济南 250001；2.济南大学，山东 济南 250001)

高选择性肼比率荧光探针的设计合成及分析应用

侯明萱1，柳彩云2

(1.山东省实验中学，山东 济南 250001；2.济南大学，山东 济南 250001)

文章为建立简便而准确的测定肼的方法，设计合成了一个以4-溴丁酸酯作为识别受体的萘酰亚胺类肼比率荧光探针。该探针能够利用比率荧光光谱法准确定量分析0～50 μM浓度肼，其检出限为0.3 μM。另外，它还具有快速响应、高的选择性和抗干扰能力强等优点，为准确定量测定肼提供了一种新的分析方法。

荧光探针；比率测定；肼；4-溴丁酸酯；萘酰亚胺

1 引言

肼作为一种重要的工业试剂广泛应用在药物和纺织染料等化合物的合成中。然而，肼易渗透皮肤组织或经口腔进入人体，破坏组织器官和神经系统[1]。美国环保署规定肼的阈值为10 ppb(0.31 μM)[2]。我国国家环境标准规定地面水和渔业水中肼的最高允许质量浓度10.0 μg/L。鉴于此，发展能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测肼的分析方法是极其重要和有意义的。

肼的检测方法很多，如：气相色谱法、高效液相色谱法和电化学检测等，但是，这些方法设备昂贵，操作繁琐。荧光光谱分析法因其具有灵敏度高、方便快捷等特点深受关注[3]。但大多荧光探针都是单一的荧光增强或者猝灭，易受到探针分布、测定环境、仪器稳定性等因素的影响。比率荧光分析法是利用荧光探针本身的发射波长处的荧光强度和与待测物反应后在另一发射波长处的荧光强度的比值作为检测信号来检测物质的一种方法。由于比率荧光探针以两个波长处荧光强度的比值作为信号参量，可以减少上述影响，进而提高了测定准确性，在一定程度上解决了传统采集单一波长信号的探针分子存在的缺陷[4]。

4-羟基-1，8-萘酰亚胺荧光团因其具有强的推拉电子体系而被广泛应用于比率荧光探针的设计中[5]；此外，已有的研究表明4-溴丁酸酯是一个理想的肼识别受体[6]。于是，设计合成了N-丁基-4-(4-溴丁酸酯基)-1，8-萘酰亚胺化合物作为肼比率荧光探针(如图1)。实验结果表明：该探针能够利用比率荧光光谱法准确定量分析0～50 μM浓度肼，其检测限为0.3 μM。另外，它还具有快速响应、高的选择性和抗干扰能力。

2 试验部分

2.1 仪器与方法

所用试剂均从供应商处购买和使用，无需进一步纯化。使用布鲁克AV-400核磁共振仪测定探针化合物的1H-NMR和13C-NMR(溶剂用氘代氯仿，四甲基硅烷作为内标)。使用硅胶(200目～300 目，青岛海阳化工有限公司)进行柱色谱分离。运用珀金-埃尔默LS-55型荧光光谱仪测定荧光发射光谱。用pH计PB-10测定pH值。

2.2 探针的合成与结构表征

将269 mg(1.0 mmol)4-羟基-1，8-萘酰亚胺和215 mg(1.3 mmol)4-溴丁酸溶于15 mL二氯甲烷中，加入97.6 mg DMAP (4-二甲氨基吡啶)、329.6 mg DCC (二环己基碳二亚胺)作为反应的催化剂，然后室温搅拌6 h，之后旋蒸得到粗产品，最后使用二氯甲烷体系进行柱色谱分离，得到黄色纯净产品371 mg，产率为89%。

图1 肼比率荧光探针的合成路线

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (*10-6): 0.965(t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.405-1.462(m, 2H), 1.658-1.717(m, 2H), 2.346-2.413(m, 2H), 3.021(t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.597(t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.161(t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.549(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.771(t, J = 7.8 Hz, 1H), 8.225(d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.575-8.619(m, 2H).13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ (*10-6): 13.92, 20.43, 27.39, 30.24, 32.53, 40.33, 68.58, 119.40, 120.54, 123.01, 125.12, 127.36, 127.55, 129.33, 131.69, 151.28, 163.46, 164.01, 170.43, 177.80.

2.3 光谱分析的步骤

用乙醇作溶剂配制浓度为1 mM的探针和胺类化合物储备液。用超纯水作溶剂制备1 mM的水合肼母液和其他分析物溶液。用移液枪移取50 μL探针储备液加入各个比色管中作为测试溶液，然后稀释溶液至10 mL，溶液体系用无水乙醇和超纯水(3:7，v/v)且含有磷酸盐缓冲溶液(5 mM，pH值为7.4)。所有的测试均在25℃下完成。使用石英比色皿(径长为1 cm)进行样品荧光光谱的测定。

3 结果与讨论

3.1 响应时间的测定

在本文中，测定体系选择的是乙醇和水(3∶7, v/v)，探针浓度为5 μM。此外，为避免溶液中pH变化引起的影响，加入浓度为5 mM的磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.4)。

探针的响应时间是探针测试性能的重要参数，探针对肼响应时间的测试是在室温25℃下进行的。如图2所示，探针在452 nm和547 nm处的荧光强度的比值随反应的进行逐渐降低，响应时间约为20 min时基本保持不变。结果表明，探针对水合肼响应时间约为20 min，其响应速率比已报道的大多数荧光探针快[7-9]。因此，下面的测试选用20 min作为测定时间。

图2 探针(5μM)对肼(100μM)响应时间的测试结果

3.2 肼的定量分析

如图3所示，随着肼逐渐的加入，探针在452 nm处的发射峰在逐渐下降，同时在547 nm处出现的新红移发射峰在不断增长。重要的是，荧光强度比率(F547/ F452)和肼浓度(0～100 μM)之间有较好的线性关系，检出限为0.3 μM。这些结果表明，探针可以利用比率荧光光谱法对肼进行准确的灵敏分析，且能够满足实际需求。

图3 不同浓度肼(0～100μM)对探针(5μM)荧光光谱的影响

3.3 肼的选择性和抗干扰能力测定

图4 不同分析物对探针(5μM)荧光光谱的影响

注：a-探针；b-正丁胺；c-乙二胺；d-三乙胺；e-二甲胺；f-醋酸铵；g-谷胱甘肽；h-硫离子；i-氯离子；j-碘离子；k-硫酸根离子；l-硫腈酸根；m-碳酸氢根；n-肼

图5 不同分析物对探针(5μM)识别肼的影响

注：a-探针；b-正丁胺；c-乙二胺；d-三乙胺；e-二甲胺；f-醋酸铵；g-谷胱甘肽；h-硫离子；i-氯离子；j-碘离子；k-硫酸根离子；l-硫腈酸根；m-碳酸氢根

4 结论

本文中建立了一种简单有效且具有高选择性和灵敏度，能够在水溶液中识别肼的荧光测量方法。新制备的比率荧光探针可用于环境保护、水处理和安全检查等方面。这种比率荧光探针越来越受到广泛的关注，同时为当前测肼荧光分子探针的设计合成提供了一种新思路。

[1] 周秋兰，谷标，尹鹏，等.一种新型水合胼荧光比率探针的合成及应用研究[J].湖南师范大学自然科学学报，2015，38(3)：47-52.

[2] 肖亮亮.基于ESIPT机理的苯并唑类荧光探针的设计、合成与应用研究[D]. 咸阳：西北农林科技大学，2015.

[3] 张健健.基于花菁骨架近红外荧光探针的设计及成像应用[D].兰州：兰州大学，2016.

[4] Hu C,Sun W.A Rationmetric Near-infrared Fluorescent Probe for Hydrazine and its in Vivo Application[J].Organic Letters,2013,15(15):4022-4025.

[5] Liu C，Wu H,Wang Z,et al.A Fast-response,Highly sensitive and Selective Fluorescent Probe for Ratiometric Imaging of Nitroxyl in Living Cells[J].Chemical Communications,2014，50(45)：6013-6016.

[6] Goswami S,Aich K,Das S,et al.Areaction based Colorimetric as well as Fluorescence“Turn on”Probe for the Rapid Detection of Hydrazine[J].RSC Advances,2014,4(27):14210-14214.

[7] 余升龙.基于香豆素和喹啉母体的小分子荧光化学传感器的研究[D].合肥：安徽大学，2016.

[8] Zhao J，Xu Y，Li H，et al. A Facile Intracellular Fluorescent Probe for Detection of Hydrazine and its Application[J].New Journal of Chemistry，2013，37(12)：3849-3852.

[9] Sun M,Guo J,Yang Q,etal.A New Fluorescent and Colorimetric Sensor for Hydrazine and its Application in Biological Systems[J].Journal of Materials Chemistry B,2014，2(13)：1846-1851.

Designed Synthesis and Analytical Application of A Highly Selective Ratiometric Fluorescent Probe for Hydrazine

HouMingxuan1,LiuCaiyun2

(1.Shandong Experimental High School, Jinan 250001, China; 2.Jinan University, Jinan 250001, China)

In this paper, a naphthalimide-derived ratiometric fluorescent probe employing 4-bromobutanoate moiety as recognition receptor for hydrazine was designed and synthesized for developing a simple and accurate method for the detection of hydrazine. The proposed fluorescent probe can detect hydrazine accurately in the range of 0～50 μM with the detection limit of 0.3 μM through ratiometric fluorescence spectra. Additionally, this probe possessed advantages including rapid response, high selectivity and anti-interference, and will provide a new assay for accurately detecting hydrazine.

fluorescent probe; ratiometric detection; hydrazine; 4-bromobutanoate; naphthalimide

2017-01-03

侯明萱(1999—)，女，山东济南人，高中；柳彩云，通信作者，讲师，博士，stu_liucy@ujn.edu.cn。

O657.3

B

1009-3028(2017)01-0054-03