一例雏番鸭新型鸭呼肠孤病毒感染的诊断

2017-06-05章秋月南平市星星畜牧有限公司福建南平353000

福建畜牧兽医 2017年3期

章秋月南平市星星畜牧有限公司福建南平353000

一例雏番鸭新型鸭呼肠孤病毒感染的诊断

章秋月南平市星星畜牧有限公司福建南平353000

2017年1月，福建省南平市延平区某养殖户饲养的雏番鸭出现大面积死亡，死亡率约45%。死亡鸭见有角弓反张、运动失调等症状。剖检死亡雏番鸭见肝脏呈现大面积点状、片状不规则出血，且伴有坏死；脾脏见有明显的脾坏死。结合临床初步诊断为新型鸭呼肠孤病毒感染。采集病死雏番鸭的肝脏和脾脏，进行细菌分离鉴定与新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测。结果表明，死亡雏番鸭细菌分离为阴性，RT-PCR试验可以特异性扩增出约586 bp的新型鸭呼肠孤病毒特异性条带，而经典呼肠孤病毒和鸭肝炎病毒未见特异性目的条带，确诊雏番鸭感染新型鸭呼肠孤病毒。

雏番鸭新型鸭呼肠孤病毒细菌分离RT-PCR鉴定

番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）感染表现为典型的“花肝病”症状，肝脏出现明显的灰白色斑样病灶，病灶大小不一、边缘无光泽。该病原在分类地位是属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属禽正呼肠孤病毒，在鸭群中主要以番鸭感染为主[1]，也见有半番鸭感染[2]，但其他品种鸭未见感染后出现明显症状。经过近些年对鸭群免疫由福建省农业科学院畜牧兽医研究所研制的“番鸭呼肠孤病毒活疫苗”[3]，番鸭感染MDRV的疫情已得到有效控制。

新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）感染为近年来新发的鸭群传染病，该病的临床症状与20世纪末期暴发于我国番鸭群的番鸭呼肠孤病毒病相似。该病可感染多品种鸭，如番鸭、半番鸭、麻鸭、樱桃谷鸭、北京鸭、白改鸭等常见鸭品种，表现为肝脏斑块状出血，并伴有坏死；脾脏有出血性坏死点（块）[4]。由于该病的部分临床症状与经典番鸭呼肠孤病毒病、鸭肝炎类似，本文通过细菌分离鉴定、病毒RT-PCR鉴别诊断，明确为新型鸭呼肠孤病毒感染，现报到如下。

1 剖检与病料采集

剖检死亡的7 d雏番鸭，可见肝脏有大面积斑点状、点状出血（见图1）。

图1 肝脏斑点状出血

自病死雏番鸭小心采集左侧肝脏（用于细菌分离鉴定）；右侧肝脏和脾脏，剪碎后，按照1:4比例加入灭菌生理盐水，匀浆后反复冻融5次，6 000 r/min离心20 min，取上清备用。

2 细菌分离与鉴定

在无菌工作台取肝脏后，在血平板进行划线，37℃培养24 h，观察结果。

3RT-PCR检测

3.1 试验试剂盒耗材病毒核酸RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、DNA分子量Marker 2000均购自福建都拜特生物试剂公司，其他化学试剂盒和耗材均购自上海生工公司福建办事处。

3.2 试验引物根据文献报道的检测经典番鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒和新型鸭呼肠孤病毒的引物，分别在上海生工生物公司进行引物合成，引物序列见表1。

3.3 病原的RT-PCR检测取处理后的离心上清液200 uL，按照病毒核酸RNA提取试剂盒提取病毒的核酸RNA，利用RT-PCR试剂盒进行病原的RT-PCR检测，反应液为20 uL体系，其中RNA 2 uL、特异性的上下游引物（各病原检测引物分别加入一个PCR反应管，浓度为10 pmol）各1 uL、2*RT-PCR一步法反应液10 uL、酶0.4 uL，补充PCR反应水至20 uL。RT-PCR反应条件为45℃逆转录25 min、95℃预变性5 min后进行PCR循环；循环35次，条件为94℃50 s、54℃30 s、72℃50 s；循环结束后，72℃再延伸7 min。取5 uL反应液进行常规琼脂糖凝胶电泳，观察病原的RT-PCR检测结果。

4 试验结果

4.1 细菌分离鉴定划线后的血平板经37℃培养24 h，未见明显菌落生长，可排除细菌感染。

4.2 病原的RT-PCR鉴定经番鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒和新型鸭呼肠孤病毒的RT-PCR检测发现，仅针对新型鸭呼肠孤病毒的引物出现特异性的目的条带（586 bp），见图2。

将该特异性RT-PCR目的条带送由上海生工进行克隆测序，将测序结果进行BLAST分析发现，其核苷酸序列与新型鸭呼肠孤病毒NP03株[7]的核苷酸同源性为99.1%。根据发病情况、剖检病变、细菌分离和RT-PCR鉴定，可确诊该病例为新型鸭呼肠孤病毒感染。

图2 病原的RT-PCR诊断（M:2000 Marker；1:新型鸭呼肠孤病毒；2:番鸭呼肠孤病毒；3:鸭肝炎病毒）

[1]胡奇林,陈少莺.番鸭呼肠孤病毒病(肝白点病)研究进展[J].福建畜牧兽医,2004,26(z1):7-9.

[2]潘晓斌,胡奇林,陈少莺,等.番鸭呼肠孤病毒病病原学研究[J].生物技术通报,2008(1):72-74.

[3]陈少莺,胡奇林,程晓霞,等.番鸭呼肠孤病毒病活疫苗创制及应用[J].中国科技成果,2016,17(13):73-74.

[4]袁远华,吴志新,黄兴国,等.新型鸭呼肠孤病毒病研究进展[J].养禽与禽病防治,2012(10):18-20.

[5]胡奇林,林锋强,陈少莺,等.应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒[J].中国兽医学报,2004,24(3):231-232.

[6]罗玉均,张桂红,陈建红,等.应用RT-PCR检测鸭肝炎病毒Ⅰ型感染[J].广东畜牧兽医科技,2007,32(3):20-21.

[7]王劭,陈少莺,陈仕龙,等.新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR方法的建立与应用[J].农业生物技术学报,2011,19(2):388-392.

A case report of novel reovirus infection with Muscovy duckling

Zhang Qiuyue
（Nanping Xingxing animal husbandry Co.,Ltd.,Nanping 353000）

In January 2017,a Muscovy breeding farm in Yanping District of Nanping in Fujian outbreak a disease at nearly 45% death with opisthotonus and ataxia symptom.The dead Muscovy duck showed large area of irregular bleeding,and accompanied by necrosis with spleen.Combined with clinical preliminary which indicated with novel reovirus infection at the Muscovy ducklings.The liver and spleen of Muscovy ducklings after grinding treatment,then with bacteria isolation and specific RT-PCR analysis.The results showed no bacterial isolates was obtained and only novel reovirus specific RT-PCR primers were tested positive with 586 bp in length, no positive results with Muscovy duck reovirus and duck hepatitis virus,which suggested that this Muscovy breeding farm outbreak novel reovirus.

Muscovy duckling Novel reovirus Bacterial isolation RT-PCR analysis