不同猪瘟病毒株在ST细胞上的增殖研究

陈景容福州大北农生物技术有限公司福州350014

不同猪瘟病毒株在ST细胞上的增殖研究

陈景容福州大北农生物技术有限公司福州350014

在做荧光抗体检测病毒中和试验时，用不同毒株检测同一份血清样品经常出现不一样的效果。通过开展猪瘟病毒（兔化弱毒株）和猪瘟病毒（法国Thiveral株）在ST细胞上的增殖研究，掌握猪瘟活疫苗收获抗原的最佳时间，选择更好的毒株进行荧光抗体检测病毒中和试验。结果表明：猪瘟病毒（兔化弱毒株）增值效果差，猪瘟病毒（法国Thiveral株）繁殖速度很快，在接种后30 h就能达到105.4TCID50/mL，55 h达到最高峰106.0TCID50/mL，72 h后呈平稳状态。

ST细胞猪瘟病毒（兔化弱毒株）猪瘟病毒（法国Thiveral株）

猪瘟是猪的最主要传染病之一，被国际兽医局（OIE）列为A类传染病。它是猪的一种急性、高度接触性、热性传染病。猪瘟病毒粒子直径为34～50 nm，有20面体对称的核衣壳，内部核心直径约30 nm，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。猪瘟病毒可引起猪体器官弥漫性出血，呈现出血斑点，其原因主要是使器官的小血管壁变性，内皮细胞发生变形、坏死所致[1]。实验条件下的猪瘟病毒很稳定，但温度对培养上清液中的病毒活性有很大的影响，病毒粒子在50℃可以存活3 d，在37℃可存活7 d，在-70℃可存活多年。猪瘟病毒的自然宿主主要是猪和野猪，不能凝集鸡、豚鼠、猪、牛和人的红细胞。猪瘟病毒可在猪的骨髓、睾丸、肺和肾的细胞培养物及白细胞中增殖，最常用的是猪肾细胞，如PK-15、SK6细胞等细胞系，其中最易感的是PK-15、PK-1a和ST等几株猪肾和猪睾丸细胞系[2]。

1 材料和方法

1.1 材料ST细胞、猪瘟病毒（法国Thiveral株）、猪瘟病毒（兔化弱毒株）

1.2 方法

1.2.1 兔化弱毒株猪瘟病毒液的培养、制备将猪瘟病毒（兔化弱毒株）按培养液总量1%接种至ST细胞单层，摇匀，放置37℃、CO2培养箱孵育1 h后，加入含3%~5%无BVDV抗体、无猪瘟抗体的胎牛血清MEM培养液，继续置37℃、CO2培养箱中，分别在培养30、50、55、60、72、96 h各取1 mL病毒液，-15℃以下冻存待检。

1.2.2 法国Thiveral株猪瘟病毒液的培养、制备将猪瘟病毒（法国Thiveral株）按培养液总量1%接种至ST细胞单层，摇匀，放置37℃、CO2培养箱孵育1 h后，加入含3%~5%无BVDV抗体、无猪瘟抗体的胎牛血清MEM培养液，继续置37℃、CO2培养箱中，分别在培养30、50、55、60、72、96 h各取1 mL病毒液，-15℃以下冻存待检。

1.2.3 间接免疫荧光试验前处理将猪瘟病毒（兔化弱毒株、法国Thiveral株）待检品做10倍系列稀释后，取10-3、10-4、10-5、10-6稀释度接种ST细胞单层（96孔细胞培养板），每孔接种100 μL，每个稀释度接种6孔。并设立阴阳性对照，阳性对照用已经确认过的猪瘟病毒（法国Thiveral株）的病毒液做6孔对照，阴性用MEM培养液作对照。放置37℃、CO2培养箱孵育1 h后，再加入含3%~5%无BVDV抗体、无猪瘟抗体的胎牛血清MEM培养液，每孔100 μL。96 h后进行间接免疫荧光试验。

1.2.4 猪瘟病毒间接免疫荧光试验步骤（1）取待检细胞单层，弃去培养液，用PBS洗涤1~2次，每次洗涤时，每孔加入PBS 200 μL，室温孵育3~5 min，弃去PBS。（2）每孔加入80%冷丙酮溶液100 μL，2~ 8℃固定30 min，然后弃去丙酮，自然晾干。（3）用PBS洗涤细胞面1次，然后每孔加入用PBS适当稀释的猪瘟病毒特异性抗体（一抗）50 μL，37℃湿盒作用1 h。（4）重复步骤（1）。（5）弃去洗液，加入用PBS适当稀释、FTC标记的兔抗猪IgG，50 μL/孔，37℃湿盒作用1 h。（6）重复步骤（1）。（7）在倒置显微镜下用蓝色激发光（波长490 nm）放大100~ 200倍观察。（8）当阳性对照孔出现典型的特异性胞浆内黄绿色荧光，阴性对照孔未出现特异性黄绿色荧光时，试验成立；否则，判定试验无结果。待检细胞孔出现特异性胞浆内黄绿色荧光，判为阳性；否则判为阴性。

2 试验结果

猪瘟病毒（兔化弱毒株、法国Thiveral株）在ST细胞增殖情况见表1、图1。从增殖曲线看，猪瘟病毒（法国Thiveral株）增殖速度还是很快的，在接种后30 h就能达到105.4TCID50/mL，55 h达到最高峰106.0TCID50/mL，72 h后呈平稳状态。

图1 猪瘟病毒（法国Thiveral株）在ST细胞增殖曲线图

3 讨论

表1 猪瘟病毒（兔化弱毒株、法国Thiveral株）在ST细胞增殖效果

猪瘟病毒复制部位仅限于细胞浆，而且不产生细胞病变。细胞培养物中病毒的传播方式呈三种：一是从感染细胞内释放的病毒粒子经培养液感染新的易感细胞；二是被感染细胞通过有丝分裂直接传给

3.1 猪瘟病毒（兔化弱毒株）在ST细胞增殖效果试验结果显示，效价小于103.0TCID50/0.1 mL。可能导致该结果的原因主要有以下几点：（1）猪瘟的血清型一般说的单一血清型，但是1976年以来，美国、法国、日本的一些学者根据中和试验和单克隆抗体反应，证明猪瘟病毒具有血清学变种。猪瘟病毒的抗原性呈多样而复杂，用多克隆抗体做交叉中和反应，发现猪瘟病毒株之间抗原性差异很大，除了双向交叉反应外，也有单向交叉反应的[4]。因此，猪瘟病毒兔化弱毒株与该试剂盒中猪瘟病毒特异性抗体存在较大差异，两者之间不容易结合，导致荧光无法显示。（2）该病毒在传代过程中丢失。（3）该病毒在该株细胞上繁殖力差，在10-3倍稀释后未能达到最低感染量。而抗原含量小于103.0TCID50/0.1 mL对做荧光抗体检测病毒中和试验是不理想的，因为抗原含量低，在接种200TCID50抗原，需要用到大量的抗原。因此，该试验未继续深入进行。

3.2 猪瘟病毒（法国Thiveral株）在ST细胞增殖效果猪瘟病毒（法国Thiveral株）是于1972年由猪瘟强毒Aifort株经仔猪原代细胞中传代后转到牛肌肉细胞中增殖，29~30℃传代170代得到的温度变异毒株，是法国曾经广泛应用的疫苗株。因其免疫荧光效果明显优于猪瘟病毒（兔化弱毒株），经常被实验室用于免疫荧光试验中的阳性对照。

从增殖曲线图可以看出，猪瘟病毒（法国Thiveral株）主要存在于细胞的胞浆中。实验室条件下猪瘟病毒很稳定，但温度对培养上清液中的病毒活性有很大的影响，病毒粒子在50℃可以存活3 d，在37℃可存活7 d，在-70℃可存活多年[5]。本试验通过在37℃条件下吸附1 h后直接加营养液，最大程度保护病毒能顺利在细胞中增殖。因此，测毒结果相对准确。

本试验通过测定不同时间段释放到上清液中的病毒来分析猪瘟病毒（法国Thiveral株）的生长特性。从增殖曲线图看，55 h达到最高峰，72 h后呈平稳状态，说明抗原收获最佳时间应在55~60 h。本试验主要是通过释放到上清液的病毒来测定病毒含量，而不是测定与细胞结合的病毒；前期滴度较低是因为上清液病毒含量较少，但是随着被感染的细胞增多，装配和释放到上清液中的病毒逐渐增多，而后达到一个高峰期，再慢慢下降。与细胞结合的病毒都呈上升趋势生长，随着时间的增加，被感染的细胞数量也增加，到72 h、96 h大部分细胞都被感染，病毒开始稳定在一定范围内。该试验还需要不断深入、细化和重复，以达到最佳效果。

[1]冶贵生.SVEC中CSFV差异基因的鉴定、cDNA序列的延伸及shRNA抑制CSFV在PK-15细胞中增殖的研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2007.

[2]Moenning V.The hog cholera virus[J].Comp Immun Microbiol Infect Disease,1992,15(3):189-201.

[3]Moormann R J M,van Gennip H G P,Miedema G K W,et al.Infectious RNA transcribed from an engineered full-leng cDNA template of the genome of a pestivirus[J].J Virol, 1996,70(2):763-770.

[4]何颖.广西猪瘟流行毒株生长特性的初步研究[D].南宁:广西大学,2004.

[5]Harkness J W.Classical swine fever and its diagnosis:A current view[J].Vet Rec,1985,16:288-293.

The study on the growth between two Hog Cholera Virus strains which germinated on the swine testicle cells

Chen Jingrong
（Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.Ltd.,Fuzhou 350014）

Fluorescent antibody virus neutralization(FAVN)test is accepted as Hog Cholera Virusantibody detection method in the international trade.But sometimes,different samples show diverse results in the FAVN test.In order to master the appropriate harvest time in hog cholera virus vaccine production and choose the optimal strain to do the FAVN test,the growth on the swine testicle cells（ST cells）between Lapinized Hog Cholera Virus and Hog Cholera Virus Thiveral strain were studied in this paper.The results showed that the proliferation of Lapinized Hog Cholera Virus was bad and the proliferation of Thiveral strain was rapid,the titer of virus can reach 105.4TCID50/mL 30 hours after inoculation,106.0TCID50/mL after 55 hours,at steady state was after 72 hours.

ST cells Lapinized Hog Cholera Virus Hog Cholera Virus Thiveral strain

A

1003-4331（2017）03-0009-03