篮式反应器发酵PCV过程中连续收获病毒的可行性研究

2017-06-05赵立民

兽医导刊 2017年4期

关键词：圆环培养液宿主

赵立民

（广东温氏食品集团股份有限公司研究院，广东新兴 527400）

篮式反应器发酵PCV过程中连续收获病毒的可行性研究

赵立民

（广东温氏食品集团股份有限公司研究院，广东新兴 527400）

应用NBS篮式细胞反应器高密度培养PK-15细胞，接种PCV病毒后，采取边补加维持液边收获病毒液的方式，最终收获相当于反应器约3倍体积的高滴度病毒抗原，生产效率明显提升，证明该工艺具备可行性。

反应器；片状载体；PK-15细胞；PCV；连续收毒

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属圆环病毒科圆环病毒属，有PCV1和PCV2两个血清型，其中 PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、仔猪先天性震颤（CT）、猪皮炎肾炎综合征（PDNS）等多种疾病的主要病原[1]，成为当前威胁我国养猪业的主要猪疾病病源之一。

目前国内兽苗企业通常采用转瓶或反应器发酵技术生产PCV病毒抗原[2]，采用一次性收获病毒的工艺，并使用氨基葡萄糖作为添加剂促进病毒扩繁。虽然该工艺均可获得较高滴度的抗原，但是病毒液收获量只相当于细胞培养体积，产率不高[3]。

篮式生物反应器是美国NBS公司产品，具有剪切力小、自动控制精准、操作简单等特点[3]。与其配套使用的片状载体内部具有网格状结构，可以为细胞生长提供高生长面积/容积比，1g载体可提供1200cm2的生长面积，利于细胞高密度生长[4]。PCV是典型的细胞外分泌型病毒，在病毒复制的过程中宿主细胞不会立即裂解死亡，本文根据PCV的这一特点，采用篮式反应器与片状载体大规模培养PK-15细胞，在收毒方法上进行了连续收获病毒液的尝试。

1 材料和方法

1.1 材料

1·1·1 细胞系与病毒

PK-15细胞，购自ATCC，100～150代；PCV2病毒，同业赠送，经特定处理后无致病性，120～180代。

1·1·2 细胞培养液

DMEM培养基（Gibco，高糖型），每升添加3.7gNaHCO3，用Millipore超纯水溶解，稀HCl调节pH至7.2后，0.22um滤芯除菌过滤；使用时生长液添加8%新生牛血清（Hyclone），维持液添加1%新生牛血清（Hyclone）。

1·1·3 试剂

葡萄糖检测试剂盒（南京建成），ELISA试剂盒（SERELISA PCV2，SYNBIOTICS），自配0.1mol/L NaOH溶液（灭活病毒用）。

1·1·4 主要设备与仪器

美国NBS篮式反应器（BIOFLO 510型，有效培养体积30～32L）及片状载体（DISK），酶标仪（Thermo），紫外分光光度计（国产美谱达），CO2细胞培养箱（Thermo 3111型），超净工作台（苏净安泰）。

1·1·5 器具

细胞培养瓶（康宁75cm2），细胞工厂（康宁5层），电动移液器（Thermo）。

1.2 方法

先期采用细胞转染的方法将PCV2病毒基因组导入PK-15细胞中，使之在培养瓶中能够正常生长传代。细胞传代培养后2天，检测细胞培养液PCV2抗原，确认阳性后利用细胞工厂扩大培养该细胞，作为反应器发酵的细胞种，期间重复检测细胞培养液PCV2抗原，确保细胞能够持续保持阳性结果。

篮式反应器装填1000g片状载体，原位高压灭菌后接种PK-15细胞，接种密度2*105个/ml接种，采用灌注培养方式进行高密度培养。5～6天后，细胞达到最大生长密度，排空培养液，注入维持液。注入维持液后约36h后开始少量收获病毒液，此后每隔12h取样4℃保存，待检病毒效价。收获病毒液时应用篮式反应器自带的蠕动泵，一边收获病毒培养液一边向反应器内补加等体积的新鲜维持液，流速以能够维持反应器内培养液的一定量的葡萄糖浓度为准，并保证反应器内的培养液体积维持在30～32L范围内。每隔4h取样检测培养液中葡萄糖浓度，以便及时调整流速。当细胞日均耗糖量下降到0.5g/L以下，耗氧曲线有明显下降趋势时，即刻终止细胞发酵，收获全部病毒液，放入4℃冷柜保存。反应器内注入事先配制好的0.1mol/L NaOH溶液，灭活罐体内病毒，防止实验室内扩散。

将上述流程中维持的葡萄糖浓度分为1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L 3个梯度，分别进行PCV2病毒发酵，相应的实验命名为实验1、实验2、实验3，将测定的数据与常规方法（不更换维持液，直接收获全部病毒液）实验4做对比。所收获的病毒溶液测定效价后全部使用0.1mol/L NaOH溶液做灭活处理。

病毒毒价测定采用ELLSA试剂盒法，结果用吸光度值表示，无单位[5]。

1.3 结果

表病毒液毒价、收毒时间、收获体积对比

图取样毒价曲线图

如下图、表，实验1～3的收获病毒结束时间分别为125h、133h、136h，实验4在接毒后72h到达毒价峰值，此时收获最佳，如不收获，毒价将持续降低。采用连续收毒方式，收获病毒的时间延长近1倍，维持的葡萄糖浓度越高，收毒的时间维持越长；收获的病毒液体积，是常规方法的3倍左右；其中实验3收获体积最多，达到96L。实验1～3的病毒液平均毒价与常规方法接近，实验2的平均毒价甚至超过了常规方法。实验1～3中取样的毒价峰值（96h左右）均高于常规方法的取样峰值（72h），而且峰值出现的时间比常规方法推后了约24h。

1.4 讨论

PCV属于细胞外分泌型病毒，在病毒复制的过程中宿主细胞逐步而非立即死亡。在常规方法中，不进行换液操作，当病毒液毒价达到峰值即进行全部收毒下罐操作，而此时大部分宿主细胞尚有活力，依然有能力继续复制病毒。采用连续收毒的方法，更换维持液后36h后即进行换液操作，因为新鲜培养基的注入，宿主细胞有较充足的营养得以进行正常的生理代谢活动，细胞活力要比同时期的常规方法高很多。另一方面，由于排出的培养液中含有病毒，同时期的病毒含量却低于常规方法。但随着时间的逐步积累，病毒含量逐步达到甚至超过常规方法的峰值，只是在时间上相应的推迟。由于细胞活力高，日耗糖量大，峰值会持续一段时间，此时连续收获的病毒液体积最多，质量也较高。

另一方面，实现连续收毒工艺与片状载体的关联很大，该型载体内部具有亲水性三维多孔隙，为宿主细胞提供较高的生长面积/容积比，宿主细胞附着在载体上能够大量繁殖，相比传统转瓶等工艺技术其细胞密度提高很大。在片状载体中，单个宿主细胞的生长形态呈球状，多个细胞聚集成葡萄串状，贴附在载体内部的纤维束上，形成立体结构。而PCV是一种细胞外分泌型病毒，在病毒复制扩增的过程中，病毒由外至内逐层侵蚀宿主细胞，使宿主细胞非同步死亡，即在一部分宿主细胞死亡的同时，另一部份宿主细胞仍存活并依旧复制病毒，正因为如此，才使本文中连续收获病毒的工艺方法得以实现。

而在更为传统的PCV2抗原生产中，采用的是细胞培养接种接毒同时进行，细胞长满更换维持液后添加氨基葡萄糖试剂，以促进病毒在细胞内的增殖，由于氨基葡萄糖对细胞无法避免的毒性，细胞在短时间内会迅速的死亡，无法达到连续收获病毒的目的。细胞种准备过程中因为细胞密度相对于反应器差距较大，其扩繁病毒的能力不足，但只要结果持续检测为阳性，在反应器中随着细胞密度的扩大与时间的累积，毒价会很快提升。

需要指出的是，本文所设定的各梯度试验中的每项参数可能并非最佳。若想采用该工艺达到病毒效价与收获量的更佳效果，需要对细胞生长状态、单日耗糖量、换液流速、培养基葡萄糖添加量、接毒后葡萄糖浓度变化等一系列参数进行优化试验，进一步提高单细胞产毒力，预计会有更大的突破进展。