不同处理方式治疗髁突囊内骨折继发颞下颌关节强直动物模型的建立

李庆华，费 伟,，郭 骏，刘 通(.西南医科大学口腔医学院，四川 泸州 646000；.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科，四川 成都 6007；.成都医学院第一附属医院口腔科，四川 成都 60500)

不同处理方式治疗髁突囊内骨折继发颞下颌关节强直动物模型的建立

李庆华1，费 伟1,2，郭 骏2，刘 通3
(1.西南医科大学口腔医学院，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科，四川 成都 610072；3.成都医学院第一附属医院口腔科，四川 成都 610500)

目的 通过建立不同处理方式治疗小型猪髁突囊内骨折继发颞下颌关节强直动物模型，进一步探索创伤性颞下颌关节强直发生的机制。方法 小型猪20只，随机分为4组，每组5只(10侧颞下颌关节)，采用手术方法造成双侧髁突囊内骨折，切除外侧部分关节盘；分别采用自然愈合、关节囊内注射生理盐水、关节囊内注射地塞米松、微型钛板内固定4种处理方式治疗囊内骨折，每一种处理方式治疗10侧。分别于术后3月、术后6月，大体、CT检查及组织学观察比较四组颞下颌关节强直的发生率。结果 自然愈合组9侧、生理盐水组4侧与地塞米松组3侧均可见关节结构消失，关节间隙变窄，髁突增生膨大；钛板固定组2侧髁突变形，关节间隙变小。结论 生理盐水、地塞米松和钛板固定三种处理方式具有减少颞下颌关节强直发生的作用，至于哪种处理方式治疗髁状突囊内骨折更佳，则需要进一步研究证实。

颞下颌关节；关节强直；囊内骨折；动物模型

颞下颌关节强直是一类严重影响患者生活质量的常见疾病，若发生在青少年时期，还会导致患者下颌畸形、咬合错乱等，甚至危害患者的心理健康。髁突囊内骨折是导致颞下颌关节强直形成的主要原因[1]，其发生的机制尚不完全清楚，为进一步探索髁突囊内骨折继发颞下颌关节强直发生过程及其发生机制，首先需要建立髁突囊内骨折的动物模型。本研究以小型猪为实验动物，通过手术方式模拟髁突囊内骨折的损伤环境，建立髁突骨折继发颞下颌关节强直的动物模型，为进一步探索创伤性颞下颌关节强直发生机制提供实验载体。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用小型猪20只，性别不限，3月龄，由成都达硕实验动物有限公司提供，体重(14.24±0.10)kg，均处于生长发育期。手术前圈养1周，观察无全身疾病、无失牙、无明显的咀嚼运动异常动作，食物为粉末状混合饲料。术前1天用数字001～020给小型猪编号并用耳钉标记，随机分为4组，每组5只，每只小型猪用双侧关节模拟髁状突囊内骨折。

1.2 手术建模 肌注3%戊巴比妥钠(1 mg/kg)实施全身麻醉。所有关节手术由同一人主刀完成，均采取耳屏前弧形切口，分别切开皮肤、皮下，沿颧弓根部剥离咬肌附着，显露关节囊。切开关节囊暴露髁突，切除前外侧部分关节盘并切断后附着使关节盘向前移位；用细裂钻在髁突外侧面从上向下磨出长约1.5 cm的骨槽，用骨凿沿骨槽将髁突折裂，但保持基底连续(图1)。然后根据分组用不同的处理方式治疗各组的髁状突囊内骨折，每一种处理方式治疗10侧关节：自然愈合组不作任何处理，观察其自然愈合；生理盐水组于关节囊内放置一根输液管并缝合固定于耳后皮肤，用以注射生理盐水，关节盘不复位；地塞米松组用同样的方法放置输液管，用以注射地塞米松磷酸钠注射液(9.68 mmol/L)；钛板固定组将髁突骨折断端复位，用微型钛板内固定，并将关节盘复位缝合固定。按分组处理方式治疗完毕后关闭关节囊，逐层缝合切口，动物清醒后送回圈养，饲养方法同术前。术后肌肉注射青霉素80万U，每天1次，连续注射3天，术后1周伤口拆线。此外，生理盐水组、地塞米松组通过输液管分别注射生理盐水、地塞米松磷酸钠注射液，每天1次，每次1 ml，连续注射4周，每次注射完成后将输液管口封闭完好，术后4周拆除固定的输液管。

图1 造成髁状突骨折的手术过程 a：切开关节囊暴露髁突；b：切除外侧部分关节盘；c：显露颞窝和髁突；d：髁突折裂(箭头所示)

1.3 主要观察指标 ①实验动物分别于术后3、6个月行CT扫描观察髁突形态及关节间隙的变化情况，扫描时动物取俯卧位，螺旋扫描范围从鼻尖至第一颈椎；②术后6个月全麻状态下测量并记录体重、最大开口度，观察咬合关系的变化。③术后6个月时采用肌注过量麻醉药的方法将动物全部处死，即刻解剖分离双侧颞下颌关节，观察关节间隙是否清晰及关节表面的解剖情况，评价是否发生关节强直。发生关节强直的判定标准[2～4]：最大开口度明显减小，且髁突有轻微动度或完全无动度；肉眼观察关节间隙消失，关节内发生纤维性或者骨性粘连；CT观察关节结构模糊，被致密的纤维性团块或骨性团块代替。④将标本置于10%(体积分数)中性甲醛溶液中浸泡48 h固定，10%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)脱钙1个月，全自动脱水机脱水，石蜡包埋。根据CT截面所示的强直区，沿关节冠状面制备5 μm厚切片，分别用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)和Masson三色染色液染色，观察关节组织结构的变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全身情况 所有动物术后进食方式、活动量同术前无明显变化，体重增加到(24.34±0.21)kg，最大被动开口度较术前明显减小，自然愈合组与其它各组的开口度比较，差异有统计学意义(P< 0.05)，见表1，咬合关系未见明显错乱，均存活到术后6个月。

表1 术前与术后6个月各组最大开口度的变化 (cm)

*与自然愈合组比较，P< 0.05

2.2 CT观察 术后3个月时，自然愈合组9侧髁突变大，关节窝变形，关节间隙不清晰；生理盐水组4侧与地塞米松组3侧的髁突形态改变，关节间隙不清晰；钛板固定组关节间隙清晰，髁突形态及关节窝表面无明显变化(图2)。术后6个月时，自然愈合组9侧关节间隙消失，髁突变得膨大且形态不规则；生理盐水组4侧与地塞米松组3侧均出现不同程度的关节间隙变小且模糊，髁突末端膨大，与颞骨关节面发生部分骨痂融合，其余髁突形态及关节间隙未见明显变化；钛板固定组有2侧显示髁突变形，关节间隙变小，其余髁突形态仍无明显变化(图3)。

图2 髁突术后3个月CT影像 a：自然愈合组；b：生理盐水组；c：地塞米松组；d：钛板固定组(箭头所示)

2.3 大体观察 肉眼所见，自然愈合组9侧(强直率90%)可见髁突形态改变，关节结构消失，膨大的髁突与关节窝连成骨球样结构，其余关节解剖界限清晰，髁突形态未见明显改变(图4)；生理盐水组4侧(40%)、地塞米松组3侧(30%)可见关节结构消失，髁突增生膨大，与颞骨关节面相互融合，呈不规则球状，探及有类骨样感，其余关节结构尚存，解剖界限模糊，关节窝表面不平，关节间隙充满纤维组织，未探及骨样组织；钛板固定组2侧(20%)可见关节窝表面凹凸不平，关节间隙模糊不清，见大量纤维组织样结构。自然愈合组出现的强直率高于其它各组，差异有统计学意义(P< 0.05)。

图4 术后6个月自然愈合组关节活体标本 a：从活体标本上可以看到颞窝和髁突增生并相互融合(箭头所示)；b：髁突增生膨大与颞骨关节面融合，呈不规则形状

2.4 组织学观察 HE染色组织切片观察可见：自然愈合组髁突与颞骨关节面本身结构不清晰，关节间隙充满了纤维结缔组织、软骨和类骨基质；生理盐水组髁突与颞骨关节面均出现软骨修复，可见大片的纤维软骨组织，局部区域可见软骨融合；地塞米松组关节间隙可见大量纤维结缔组织，而骨组织修复弱于其它组；钛板固定组髁突表面软骨组织消失，局部可见骨质吸收(图5)。Masson染色观察可见：自然愈合组和生理盐水组关节间隙充满了胶原纤维及新生软骨样组织；地塞米松组关节间隙可见新生胶原纤维，而新生软骨少见，钛板固定组关节表面无胶原纤维增生(图6)。

图5 术后6个月组织学观察(HE染色 × 400) a.自然愈合组；b.生理盐水组；c.地塞米松组；d.钛板固定组

图6 术后6个月组织学观察(Masson染色 × 400) a.自然愈合组；b.生理盐水组；c.地塞米松组；d.钛板固定组

3 讨论

创伤性颞下颌关节强直发生的机制非常复杂，为了研究其发病机制及治疗效果必须建立近似人类发病过程的动物模型，而建立动物模型必须选择合适的实验动物。从关节的解剖和组织学结构考虑，猴可以近于真实地模拟人的颞下颌关节[5]，是最理想的实验动物，但其使用受到限制。猪与人都是杂食动物，且饲养、捕捉及实验操作容易进行，故对于研究有关颞下颌关节的疾病，小型猪是一种比较合适的实验动物[6]。正常小型猪的颞下颌关节与人的颞下颌关节相似，由下颌骨的髁状突、颞骨的关节窝、关节盘、关节囊和关节韧带等构成，关节结节和关节窝表面光滑，有光泽[7]。

关节盘是颞下颌关节重要的组成部分，Miyamoto等[8]通过切除成年绵羊髁突软骨和关节盘实验证实关节盘可以阻止纤维性颞下颌关节强直的发生。Xiang等[9]通过对385例髁状突骨折术后继发颞下颌关节强直的患者进行回顾性研究，发现关节盘损伤移位在颞下颌关节强直发生中具有重要的作用。Yang等[10]临床研究发现关节盘的损伤移位及受损的关节骨相互接触促进了颞下颌关节强直的发生，而关节盘的存在可以阻止强直的发生。因此为有效而真实地模拟临床过程，并建立颞下颌关节强直模型，本实验所有颞下颌关节均破坏关节软骨和切除外侧部分关节盘并切断后附着使关节盘前移位，术后6个月CT及组织学结果显示自然愈合组9侧、钛板固定组2侧都出现了不同程度的纤维强直或骨性强直。分析本实验建立的髁状突囊内骨折损伤环境，切除部分关节盘并使关节盘前移位造成颞骨关节面与髁突损伤面紧密接触，关节盘的缺失造成阻挡强直骨桥形成的屏障作用消失，使髁突的骨折断面所暴露的骨髓腔起到了成骨诱导的作用，从而促进了关节强直的发生。本实验中钛板固定组将骨折复位固定的同时也将关节盘复位并缝合固定，而自然愈合组没有将移位的关节盘复位，结果显示自然愈合组的强直发生率显著高于钛板固定组(P< 0.01)，此表现类似于临床情况。本实验组织学发现，各种成熟阶段的新生骨基质、软骨基质和胶原纤维同时存在于不同区域，说明关节强直是一个动态发展过程，这与王霄等[11]动物实验的研究发现相同。

10岁左右的青少年处于生长发育期，髁突为下颌骨发育的中心点之一，具有生长发育及改建功能，一旦发生髁突骨折，其继发颞下颌关节功能障碍的可能性较大[12]。目前，对于髁状突骨折主要有手术治疗和保守观察治疗两大类。但是无论选择哪种方法，髁状突骨折治疗后都有可能出现下颌偏斜、开口型异常、关节功能紊乱和下颌骨发育障碍等并发症。Zhao等[13]通过可摘式咬合夹板治疗40名儿童和青少年髁状突骨折的回顾性研究证实儿童髁状突骨折采用保守治疗取得了满意的疗效。Kolk等[14]通过临床随访研究发现开放复位内固定在治疗下颌骨髁状突骨折中取得了满意的疗效。而Forouzanfar等[15]通过对双侧髁状突骨折的患者保守观察治疗后长期随访中提出，开放或者保守治疗下颌骨髁状突骨折哪种方法更好仍值得商榷。本实验模拟临床手术治疗方法复位骨折并用微型钛板内固定，实验结果显示，自然愈合组发生的强直率显著高于钛板固定组(P< 0.01)。此外，研究发现长期大剂量应用糖皮质激素可通过升高 DKK-1的表达抑制成骨细胞的Wnt信号通路，促进成骨细胞脂肪化，从而抑制成骨细胞的骨形成活性[16]。多位学者研究发现，颞下颌关节腔内局部注射糖皮质激素能有效治疗幼年特发性关节炎[17，18]。本实验以此为切入点，用地塞米松磷酸钠注射液注入关节囊内试图探索一种预防颞下颌关节强直的新方法。由于髁状突囊内骨折常伴有关节腔内出血，而关节腔的血肿机化是导致颞下颌关节强直的始发因素之一，本实验中用生理盐水注入关节囊达到灌洗作用，以清除关节腔内产生的血肿，试图达到预防颞下颌关节强直发生的目的。结果发现生理盐水组4侧与地塞米松组3侧髁突均变形膨大，与颞骨关节面有不同程度的融合，可见类骨质形成。由此可见，单纯用生理盐水灌洗囊内血肿并不能有效阻止颞下颌关节强直的发生，而地塞米松能否有效预防颞下颌关节强直发生尚需要进一步研究。

本实验建立的实验动物模型重现了临床上髁突囊内骨折继发颞下颌关节强直的发生过程，实验具有可重复性。此外本研究发现钛板固定组比其它三组更能有效减少颞下颌关节强直的发生，其具体作用机制尚需进一步研究。

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Development of animal models of temporomandibular joint ankylosis by different treatment approaches for intracapsular condylar fracture

LIQing-hua1，FEIWei1,2，GUOJun2，LIUTong3
(1.SchoolofStomatology，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，China； 2.DepartmentofStomatology，SichuanProvincialAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China； 3.DepartmentofStomatology，TheFirstAffiliatedHospital，ChengduMedicalCollege，Chengdu610500，China)

FEIWei

Objective To further explore the mechanisms of traumatic temporomandibular joint (TMJ) ankylosis through development of animal models by different treatments of intracapsular condylar fracture in miniature pig.Methods We randomly divided 20 miniature pigs into 4 groups，5 animals (10 joints) in each group.The bilateral intracapsular condylar fractures were induced by adopting the method of operation with removing the lateral part of articular disc.The animals were treated with 4 types of different treatments including natural healing，injection of saline solution into joint capsule，injection of hexadecadrol into joint capsule and internal fixation with miniature titanium plate.Each type of treatment was used for 10 sides.All animals were sacrificed at the end of six months postoperatively.The incidence of traumatic TMJ ankylosis was evaluated by gross specimen，imaging and histological examination.Results The joint structure disappear，joint space narrow and condylar hyperplasia enlargement could be observed in 9 sides of joints in the natural healing group，4 sides of joints in the normal saline group，and 3 sides of joints in the dexamethasone group while these changes were only observed in 2 sides of joints in the miniature titanium plate fixation group.Conclusion The normal saline，dexamethasone and titanium plate fixation could reduce the occurrence of TMJ ankylosis.However，further studies are needed to investigate which method is better for treatment of intracapsular condylar fractures.

Temporomandibular joint (TMJ)； Ankylosis； Intracapsular condylar fracture； Animal model

费 伟

R782.6+1

A

1672-6170(2017)03-0015-05

2017-01-05；

2017-03-09)