枸杞子残渣中多糖的提取工艺研究

龙晓燕,叶 林,蔡林军,刘 艺

(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010)

枸杞子残渣中多糖的提取工艺研究

龙晓燕,叶 林,蔡林军,刘 艺

(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010)

以煎煮法提取枸杞子残渣中的枸杞多糖,以提取次数、提取时间和料液比三个因素为考察因素,以枸杞多糖得率为评价指标,在单因素实验基础上采用正交实验优选枸杞多糖提取工艺。优化的枸杞多糖的提取条件如下:水煎煮提取3次,每次提取40 min,料液比为1∶40 (g/mL),此条件下的枸杞多糖平均得率为10.65%。正交实验对枸杞子残渣中的枸杞多糖的提取条件优化合理可行,为提高枸杞多糖的得率提供了理论依据。

枸杞子残渣,提取工艺,多糖,正交实验

枸杞为茄科枸杞属植物(Lycium linn.),是茄目茄科枸杞属植物[1],其干燥成熟的果实-枸杞子是传统的滋养肝肾、明目中药,在我国和其它亚洲国家应用已达2000多年[2-3]。为中国食品药品监督管理总局规定的既是食品又是药品的物品。枸杞的药用价值在我国有着悠远的历史,始载于《神农本草经》,被列为上品,谓之:“久服坚筋骨,轻身不老,耐寒暑”。现代研究表明枸杞子中的主要化学成分有多糖、类胡萝卜素、多酚、蛋白质、生物碱、超氧化物歧化酶等[4-5]。枸杞子残渣是提取枸杞油后的副产物,常做动物饲料利用或作为药渣直接丢弃,枸杞子残渣中枸杞多糖含量丰富,是一种具有多种生物活性的糖蛋白。枸杞的视神经保护作用的物质基础是枸杞多糖[6]。枸杞具有的抗缺氧、抗疲劳、防衰老、降血糖、强免疫、保护视力、抗氧化、抗癌等的药理作用的物质基础都与枸杞多糖密切相关[7-10]。因此,考虑从枸杞子残渣中提取并研究枸杞多糖,变废为宝。目前,对枸杞多糖的提取方法有水提法、碱提法、酶解提取、微波提取以及超声提取[11-13]。但是,中药最常用的使用方法是水煎法,尽管目前对枸杞多糖的提取研究方法中涉及水提法,其提取时间长达5.5 h[14]。枸杞作为传统的补益中药,煎煮时间以1 h左右为宜。本文采用传统煎煮法提取枸杞子残渣,通过单因素和正交实验来探讨枸杞多糖的提取工艺,为枸杞子残渣资源综合开发提供技术支持,同时为药食两用药材枸杞子的煎煮方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞子残渣(为CO2超临界萃取枸杞油后的残渣) 青海康普生物工程有限公司提供;浓硫酸、苯酚、葡萄糖、氢氧化钠、酒石酸钾钠、无水乙醇、3-5-二硝基水杨酸钠 均购自绵阳市信捷商贸有限公司 为分析纯。

RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;HH-S4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;SHB-ⅢS循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司;HD4917电磁炉 珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司;KQ5200 B超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;DH-030(A)电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;X63L-6多功能分体煲 潮州市潮安区奇巧贸易有限公司;J-26XP Beckman冷冻离心机 Beckman Coulter;U-3900H分光光度计 HITACHI。

1.2 实验方法

1.2.1 总糖的含量测定 采用苯酚-硫酸法测定溶液在490 nm处的吸光度[15]。对照品溶液的制备:取无水葡萄糖加纯水制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作为对照品溶液;标准曲线的制备:量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别置具塞试管中,加纯水补至2 mL,各管精密加入5%苯酚溶液1 mL,摇匀,迅速精密加入浓硫酸5 mL,摇匀,静置10 min,冷却至室温,置40 ℃水浴中保温15 min,取出,迅速冷却至室温,以相应的试剂为空白对照,在490 nm波长处测定吸光度,以葡萄糖浓度作为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2 还原糖含量的测定 采用3,5-二硝基水杨酸比色法在540 nm处测定其吸光度[16]。3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液的配制:取酒石酸钾钠182 g,溶于500 mL纯水中,加热溶液但温度不超过50 ℃,并依次加入6.3 g 3,5-二硝基水杨酸,21 g氢氧化钠,5.0苯酚和5.0 g无水亚硫酸钠,搅拌至完全溶解,冷却至室温后转移到1000 mL的棕色容量瓶中,并用纯水定容至刻度。对照品溶液的制备:取无水葡萄糖加纯水制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作为对照品溶液。标准曲线的制备:取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别置具塞试管中,加纯水补至1 mL,各管分别加入1 mL DNS溶液,混匀后于沸水中加热5 min,冷却至室温,每管再加入8 mL纯水,摇匀。以相应的试剂为空白对照,在540 nm波长处测定吸光度,以葡萄糖浓度作为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.4 枸杞子残渣中枸杞多糖提取的单因素实验及正交实验设计 取枸杞子残渣约20 g,于70 ℃烘干至恒重,精密称定,按下述方法分别置于中药煎煮锅中提取相应的次数和时间,实验结束时补充损失的水分。在提取料液比为1∶35 (g/mL)、提取时间30 min条件下,探究提取1、2、3、4次对枸杞多糖得率的影响;在提取料液比为1∶35 (g/mL)、提取次数为3次条件下,探究提取时间15、25、35、45、55 min对枸杞多糖得率的影响;在提取次数为3次、提取时间为30 min条件下,探究料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 (g/mL)对枸杞多糖得率的影响。

在单因素实验的基础上,依照L9(34)空一列正交实验设计方案,对提取次数、提取时间和料液比三因素的条件进行优化提取枸杞多糖,实验方案如表1。

表1 煎煮法提取枸杞多糖的正交实验因素与水平

2 结果与分析

2.1 总糖及还原糖标准曲线

根据不同方法及不同浓度的葡萄糖标准溶液及其对应的吸光度,得到苯酚-硫酸法的回归方程为y=6.0007x-0.0048,R2=0.9985,表明在总糖在0. 041～0.204 mg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。3,5-二硝基水杨酸法的回归方程为y=1.4544x-0.0203,R2=0.9996,表明在还原糖在0. 204～1.018 mg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

图1 总糖测定标准曲线Fig.1 Standard curve for total sugar determination

图2 还原糖测定标准曲线Fig.2 Standard curve for reducing sugar determination

2.2 单因素对枸杞多糖得率的影响

2.2.1 提取次数对枸杞多糖得率的影响 从图3可知,枸杞多糖得率随提取次数的增多而增大,这是因为煎煮枸杞子残渣时,枸杞多糖首先溶解在枸杞子残渣组织的水中,再扩散到枸杞子残渣外部的溶液中,至枸杞子残渣内外溶液的浓度达平衡时,枸杞多糖不再继续溶出。这时只有将药液滤出、重新加水,建立新的浓度差,枸杞多糖才能继续溶出。煎煮次数少,枸杞多糖提取不完全[19]。提取次数为3次时的枸杞多糖得率为10.21%,之后随着提取次数的增加而平缓上升,当提取次数增加到4次时,枸杞多糖得率达到最大值,为10.24%。方差分析结果表明,提取次数为3次时的枸杞多糖得率显著(p<0.05)大于提取1次和提取2次的枸杞多糖得率。综合考虑产率、能耗以及长时间加热对枸杞多糖的影响等因素,选取提取1次、2次、3次三个水平用于正交实验设计。

图3 提取次数对枸杞多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction times on the rate of crude polysaccharides from Lycium barbarum residue

2.2.2 提取时间对枸杞多糖得率的影响 由图4可以看出,当提取时间为15～35 min时,枸杞多糖得率明显增加,这是由于当枸杞多糖浓度未达饱和时,增加煎煮时间有利于枸杞多糖的溶出。提取时间过短,枸杞多糖浸出不完全,枸杞子残渣中的枸杞多糖转移率低,易造成枸杞子残渣的浪费。随着枸杞多糖提取时间的延长,枸杞多糖大分子就有充分的时间从枸杞子残渣中扩散到水溶液中。当提取时间为35～55 min时,枸杞多糖得率增加平缓。方差分析结果表明,提取时间为35 min时的枸杞多糖得率显著(p<0.05)高于提取30 min。再延长提取时间,对枸杞多糖的得率趋于平稳。故选取提取35、40、45 min三个水平用于正交实验设计。

图4 提取时间对枸杞多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the rate of crude polysaccharides from Lycium barbarum residue

2.2.3 料液比对多枸杞多糖得率的影响 中药浸出成分的扩散速度符合Ficks 第一扩散定律[dM/dt=-D·S(dC/dX)],式中dM/dt为扩散速度(一定时间内物质扩散的量),dt为扩散时间,S为扩散面积,D 为扩散系数,dC/dX为浓度梯度[19]。在枸杞多糖的提取过程中,枸杞子残渣中枸杞多糖的dC/dX不断减小,而药液中枸杞多糖浓度逐渐升高,直至枸杞子残渣中枸杞多糖浓度与药液中枸杞多糖浓度达平衡状;但如果水的用量过多,会造成枸杞多糖的生产成本升高,也给枸杞多糖提取液的浓缩造成了困难。故控制水的用量很关键。由图5可以看出,料液比对枸杞多糖得率的影响较大。在料液比为1∶15～1∶30范围内,枸杞多糖的得率从3.68%迅速增大到9.71%,到了1∶30 (g/mL)以后趋于平稳。方差分析结果表明,料液比为1∶30时,枸杞多糖的得率显著(p<0.05)大于料液比为1∶25的枸杞多糖得率。故选取料液比为1∶30、1∶35和1∶40三个水平用于正交实验设计。

图5 料液比对枸杞多糖得率的影响Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on the rate of crude polysaccharides from Lycium barbarum residue

2.3 煎煮法提取枸杞多糖正交实验及结果分析

煎煮法提取枸杞多糖的最佳工艺条件。选取因素及实验结果见表2。从表2中分析得出,三种考察因素对枸杞多糖得率影响的大小顺序为:A>C>B,即提取次数对于枸杞多糖得率影响最大,料液比影响次之,提取时间影响相比较而言较小。由实验的结果可以确定主要的影响参数A3B2C3,即提取3次,提取时间40 min,提取料液比1∶40 (g/mL)。

表2 煎煮法提取枸杞多糖正交实验因素及实验结果

表3 方差分析结果

从表3的方差分析可知,只有提取次数一项因素对枸杞多糖得率的影响达到显著性(p<0.05)性水平,表明选定的提取时间和料液比水平对枸杞多糖的得率没有显著影响,考虑实际操作成本,选取提取时间为30 min,料液比为1∶30 (g/mL)。

2.4 验证实验

经极差分析,当组合为A3B2C3,即提前次数为3次,提取时间为40 min,料液比为1∶40 (g/mL)时,枸杞多糖的得率最大,由于最佳工艺条件未出现在正交实验表之中,故按上述工艺条件进行验证,计算得出枸杞多糖得率为10.65%±0.21%。

从生产考虑,可选择提取3次,每次30 min,料液比为1∶30 (g/mL)的工艺进行验证后,计算得出枸杞多糖得率为:9.71%±0.37%。

3 结论

本实验通苯酚-硫酸法和3,5-二硝基水杨酸法测定并计算枸杞多糖的得率,通过单因素实验找到提取次数、提取时间、料液比的最佳提取参数,再利用正交实验进行了优化。由正交实验结果可知,在影响枸杞多糖提取的三个因素中,其影响大小依次为提取次数,料液比,提取时间,其中提取次数对实验结果有显著影响。最终确定的提取条件为提取3次,提取时间40 min,提取料液比1∶40 (g/mL)。在此提取条件下,枸杞多糖得率为10.65%。本实验可以为枸杞残渣资源综合开发提供依据,为枸杞残渣的再利用提供理论支持,同时为药食两用药材枸杞的煎煮方法提供了科学依据。

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Extraction of polysaccharide inLyciumbarbarumresidue

LONG Xiao-yan,YE Lin,CAI Lin-jun,LIU Yi

(School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

The aim of this study was to investigate the effect of extraction times,extraction time and solid to liquid ration on the extraction rate of crude polysaccharides fromLyciumbarbarumresidue(PLB). An orthogonal test was used to confirm the optimal extractive parameters based on the single factor experiments. The results of the optimum extraction conditions were as follows:number of extraction of 3 times,extraction-duration of 40 min every time,water to raw material ratio at 1∶40 (g/mL). The average extraction rate for the polysaccharide was 10.65%. The optimization of PLB was reasonable and feasible. The results provide the theoretical base for improvement of PLB extraction rate.

Lyciumbarbarumresidue;extraction technology;polysaccharide;orthogonal experiment

2016-11-14

龙晓燕(1974-),女,博士研究生,副教授,研究方向:天然产物的研究与开发,E-mail:longxiaoyan@swust.edu.cn。

TS255.1

B

1002-0306(2017)09-0248-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.038